1. EL CONCEPTO DE HIBRIDACIÓN Y SU APLICACIÓN EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Unión, por complementariedad de bases, de 2 moléculas monocatenarias de ác. nucleicos dando
lugar a una molécula híbrida bicatenaria:
ADN-ADN
ARN-ARN
ADN-ARN
Aplicaciones en biología molecular: detección de secuencias diana usando sondas (fragmentos
complementarios) marcadas.
Hay diferentes técnicas de hibridación según:
-El tipo de ác. nucleico que se pretende detectar
-El tipo de sonda que se va a usar
-El tipo de marcaje de la sonda
-El medio de soporte (sólido, líquido o in situ):
Soporte sólido: Dot blot, Southern blot, Northern blot, Microarrays
Soporte líquido: Técnica de captura de hibrido, Técnica de ADN ramificado
Hibridación in situ (ISH) (se hace en extensiones citológicas o seciones de tejido): FISH
(Hibridación in situ fluorescente), CISH (Hibridación in situ cromogénica)
2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
Se basa en los fenómenos de desnaturalización y renaturalización
2.1. DESNATURALIZACIÓN
Separación de las 2 cadenas de ADN por rotura de los puentes de hidrogeno entre las bases
complementarias. Se consigue aumentando la Tª y el pH (en estos niveles influye la composición
de las bases según el nº de enlaces por puentes de hidrógeno que las unan).
Su comportamiento se representa en la curva de fusión del ADN.
CURVA DE FUSIÓN DEL ADN: si se mide la A260 de una solución de una molécula bicatenaria
de ADN en función de la Tª, se obtiene una curva sigmoide con 3 zonas:
1. Es un tramo recto sin pendiente debido a que A260 tiene un valor constante, aunque aumente
la Tª. Este valor corresponde al valor basal de absorbancia de la molécula bicatenaria y depende
únicamente de la concentración de la molécula de ADN en solución.
1
, La Tª no alcanza un valor suficiente para romper los puentes de hidrogeno y, por tanto, el
porcentaje de desnaturalización es 0%, es decir, todo el ADN está en forma de doble hélice
bicatenaria.
2.En este tramo se observa un aumento de la absorbancia a medida que aumenta la Tª, primero
de manera lenta (curva cóncava), después de forma rápida (recta con pendiente elevada) y
finalmente de manera lenta nuevamente (curva convexa) hasta un valor de absorbancia máximo.
En este rango de temperaturas es donde se produce la desnaturalización progresiva de la
molécula de ADN, de manera que al alcanzarse el valor máximo de absorbancia la
desnaturalización es del 100%. El aumento de absorbancia a medida que la molécula se
desnaturaliza se conoce como efecto hipercrómico.
3. La gráfica de esta zona corresponde a un recta de pendiente prácticamente nula, debido a que
la absorbancia se mantiene en el valor máximo, aunque la Tª siga aumentando. En esta fase el
ADN se mantiene desnaturalizado al 100%.
TEMPERATURA DE FUSIÓN:
La Tª de fusión (Tmelting): la Tª en la cual el valor de A es la mitad entre el valor basal y el valor
máximo; es la Tª a la que el 50% del ADN está desnaturalizado
Depende de:
-Moléculas pequeñas (de menos de 500 pb): mayor Tm a mayor longitud.
-Moléculas grandes: la Tm depende del %GC (ya que estas están unidas por 3 puentes de
hidrógeno), es decir, a mayor %GC, mayor será la Tm. Por lo que, la Tm de las moléculas de
gran tamaño está directamente relacionada con el contenido de pares GC.
2.2. RENATURALIZACIÓN
Las 2 cadenas de ADN completamente separadas por desnaturalización térmica vuelven a
reasociarse al bajar lentamente la Tª hasta formas la doble hélice original.
2
Unión, por complementariedad de bases, de 2 moléculas monocatenarias de ác. nucleicos dando
lugar a una molécula híbrida bicatenaria:
ADN-ADN
ARN-ARN
ADN-ARN
Aplicaciones en biología molecular: detección de secuencias diana usando sondas (fragmentos
complementarios) marcadas.
Hay diferentes técnicas de hibridación según:
-El tipo de ác. nucleico que se pretende detectar
-El tipo de sonda que se va a usar
-El tipo de marcaje de la sonda
-El medio de soporte (sólido, líquido o in situ):
Soporte sólido: Dot blot, Southern blot, Northern blot, Microarrays
Soporte líquido: Técnica de captura de hibrido, Técnica de ADN ramificado
Hibridación in situ (ISH) (se hace en extensiones citológicas o seciones de tejido): FISH
(Hibridación in situ fluorescente), CISH (Hibridación in situ cromogénica)
2. BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN
Se basa en los fenómenos de desnaturalización y renaturalización
2.1. DESNATURALIZACIÓN
Separación de las 2 cadenas de ADN por rotura de los puentes de hidrogeno entre las bases
complementarias. Se consigue aumentando la Tª y el pH (en estos niveles influye la composición
de las bases según el nº de enlaces por puentes de hidrógeno que las unan).
Su comportamiento se representa en la curva de fusión del ADN.
CURVA DE FUSIÓN DEL ADN: si se mide la A260 de una solución de una molécula bicatenaria
de ADN en función de la Tª, se obtiene una curva sigmoide con 3 zonas:
1. Es un tramo recto sin pendiente debido a que A260 tiene un valor constante, aunque aumente
la Tª. Este valor corresponde al valor basal de absorbancia de la molécula bicatenaria y depende
únicamente de la concentración de la molécula de ADN en solución.
1
, La Tª no alcanza un valor suficiente para romper los puentes de hidrogeno y, por tanto, el
porcentaje de desnaturalización es 0%, es decir, todo el ADN está en forma de doble hélice
bicatenaria.
2.En este tramo se observa un aumento de la absorbancia a medida que aumenta la Tª, primero
de manera lenta (curva cóncava), después de forma rápida (recta con pendiente elevada) y
finalmente de manera lenta nuevamente (curva convexa) hasta un valor de absorbancia máximo.
En este rango de temperaturas es donde se produce la desnaturalización progresiva de la
molécula de ADN, de manera que al alcanzarse el valor máximo de absorbancia la
desnaturalización es del 100%. El aumento de absorbancia a medida que la molécula se
desnaturaliza se conoce como efecto hipercrómico.
3. La gráfica de esta zona corresponde a un recta de pendiente prácticamente nula, debido a que
la absorbancia se mantiene en el valor máximo, aunque la Tª siga aumentando. En esta fase el
ADN se mantiene desnaturalizado al 100%.
TEMPERATURA DE FUSIÓN:
La Tª de fusión (Tmelting): la Tª en la cual el valor de A es la mitad entre el valor basal y el valor
máximo; es la Tª a la que el 50% del ADN está desnaturalizado
Depende de:
-Moléculas pequeñas (de menos de 500 pb): mayor Tm a mayor longitud.
-Moléculas grandes: la Tm depende del %GC (ya que estas están unidas por 3 puentes de
hidrógeno), es decir, a mayor %GC, mayor será la Tm. Por lo que, la Tm de las moléculas de
gran tamaño está directamente relacionada con el contenido de pares GC.
2.2. RENATURALIZACIÓN
Las 2 cadenas de ADN completamente separadas por desnaturalización térmica vuelven a
reasociarse al bajar lentamente la Tª hasta formas la doble hélice original.
2
