1. Restrictie digestie
Doel = Het knippen van de mutant met specifieke restrictie-enzymen en dit visueel weergeven op
een gel
Restrictie enzymen zijn nucleases (breken nucleïnezuren af) en knippen de suiker-fosfatase ‘bone’
van het DNA. Ze komen origineel van bacteriën. Ze herkenning palindromische nucleotide sequentie.
Je hebt restrictie enzymen die zorgen voor single-stranded sticky ends (kleine overhang aan beide
kanten) of blunt ends (recht afgeknipt).
Buffer enzym voor de enzymen (FastDigest buffer) heeft glycerol in zich en dit is om te zorgen dat de
enzymen niet kapot gaan vanwege dat ze bewaard worden op ongeveer -20°C
palindromsiche sequentie
Dubbele digestie = Met twee restrictie enzymen knippen.
- EcoRI
- HinDIII
Enkele digestie = Positieve controle voor de restrictie enzymen om te kijken of ze wel echt goed
werken.
Negatieve controle = Zonder DNA om te kijken of er niks geknipt wordt zonder dat er DNA aanwezig
is.
Waarom op het hitteblok? -> Optimale temperatuur voor de restrictie enzymen om te werken is bij
37 °C
FastDigest buffer = Zorgt ervoor dat de pH van de reactie (meestal 8.0) op peil blijft en zorgt voor een
goede omgeving voor de enzymen. Werkt deze buffer niet kunnen de restrictie enzymen niet
optimaal werken en zullen de restrictie enzymen ook niet tegelijk gaan knippen en dat het in één
reactie kan.
Mogelijke oorzaken problemen:
- Wel bandjes te zien maar verkeerd
o Waarschijnlijk niet bij de gel
o Door restrictie digestie zelf
Verkeerde restrictie enzymen
Verkeerde hoeveelheid DNA toegevoegd
Te weinig/geen buffer waardoor enzymen niet goed werken
Suboptimale condities
Belangrijk: Doordat de concentratie vrij hoog zal zijn van het DNA, zal niet alles geknipt worden. Dit
betekent dat er nog bandjes zichtbaar kunnen zijn bij 7024, wat gelijk staat aan ongeknipt.
1
, 2. Agarose gel elektroforese
Doel = PCR product visualiseren
DNA gel elektroforese is een techniek waar bij DNA moleculen worden gescheiden op basis van hun
grootte. Door het elektrische stimuleren van de DNA moleculen zullen ze richting het positieve deel
willen gaan (onderin) waarbij grotere moleculen langzamer bewegen dan kleinere moleculen.
Hoe hoger het percentage van je gel hoe langzamer de delen van je gel zullen runnen naar de
onderkant. Als je een te hoog percentage agarose in je gel hebt gedaan kan je hem voor een lagere
tijd runnen om te zorgen dat je toch goed je bandjes kan visualiseren. Hoe hoger je percentage van je
gel hoe kleiner de bandjes zijn die je kan visualiseren, dus hoe preciezer je gel is.
Hoe hoger je running voltage/microA hoe sneller het zal gaan. Laat je je gel te lang runnen dan zullen
alle samples uiteindelijk zakken tot de onderkant van je gel, dan kan je niks meer aflezen. Je doet een
high en low range ladder zodat je de grootte van de bandjes het beste kan bekijken.
Appearance Band _
Linear
B
Nicked (one the DNA-strands is broken)
A
Supercoiled (DNA is extra folded and thus
very compact)
C
+
Lineair DNA kan beter door de gel dan circulair DNA. Supercoiled DNA gaat soms wel sneller dan
lineair DNA, maar dit hoeft niet altijd zo te zijn.
Waarom midori green? -> Om de bandjes te visualiseren op je gel, anders hebben ze geen kleur.
Waarom loading dye? -> Geeft kleur aan de samples om ze te visualiseren en zorgt voor de loading
process. Daarnaast verhoogt het de dichtheid van je sample waardoor de samples goed runnen in je
gel. Is niet altijd nodig omdat de voornaamste functie is om de dichtheid van je sample te verhogen.
TAE buffer = Zorgt ervoor dat nucleaire zuren kunnen bewegen in de agarose mix. Het behoudt ook
de pH en ion concentraties tijdens de elektroforese.
2
, 3. Sanger Sequencing
Doel = Het bepalen van de basenparen volgorde van de verkregen mutatie
Vergeleken met de PCR gebruikt sanger sequencen niet alleen dNTPs, maar ook ddNTPs. Deze
hebben geen 3’ hydroxyl groep aan zich waardoor ze dus niet zorgen voor elongatie van het DNA
maar stoppen bij een bepaalde base.
Berekening primer
Hoeveelheid nodig = 7.5 pmol -> 7.5 x 10 -6 µmol (0.0000075
Concentratie = 5µM
Aantal µL nodig = 7.5 x 10- = 0.0000015 L = 1,5 µL
NR3C1 gen ->
- 17 transcripten
- Verdeeld over het genoom (chromosoom 5) en resulteren in verschillende eiwitten
- cDNA -> Eiwit coding
cDS -> eiwit coding
DNA: chromosoom GrCH
Coverage = In hoeverre twee stukken DNA dezelfde lengte hebben (exact evenveel basenparen =
100% coverage)
Lage coverage -> klein stuk DNA vergelijken
Hoge identity -> Je hebt een klein stuk maar die is wel exact hetzelfde als dat stuk van je
referentie
Identity = In hoeverre twee stukken DNA dezelfde nucleotide sequentie hebben (exact zelfde
sequentie = 100%)
4. PCR
Doel = Het vermeerderen van een DNA fragment van de hGR-EGFP
plasmide. Dit product wordt gevisualiseerd door middel van een
agarose gel.
De polymerase chain reaction wordt gebruikt om het DNA te
verlengen door thermocycling – cycli van temperatuurverschillen op
vaste tijdsintervallen. Je maakt gebruik van een thermostabiele DNA polymerase en kan door middel
van deoxynucleotides (dNTPs) meerdere kopieën van een DNA streng maken.
3
Doel = Het knippen van de mutant met specifieke restrictie-enzymen en dit visueel weergeven op
een gel
Restrictie enzymen zijn nucleases (breken nucleïnezuren af) en knippen de suiker-fosfatase ‘bone’
van het DNA. Ze komen origineel van bacteriën. Ze herkenning palindromische nucleotide sequentie.
Je hebt restrictie enzymen die zorgen voor single-stranded sticky ends (kleine overhang aan beide
kanten) of blunt ends (recht afgeknipt).
Buffer enzym voor de enzymen (FastDigest buffer) heeft glycerol in zich en dit is om te zorgen dat de
enzymen niet kapot gaan vanwege dat ze bewaard worden op ongeveer -20°C
palindromsiche sequentie
Dubbele digestie = Met twee restrictie enzymen knippen.
- EcoRI
- HinDIII
Enkele digestie = Positieve controle voor de restrictie enzymen om te kijken of ze wel echt goed
werken.
Negatieve controle = Zonder DNA om te kijken of er niks geknipt wordt zonder dat er DNA aanwezig
is.
Waarom op het hitteblok? -> Optimale temperatuur voor de restrictie enzymen om te werken is bij
37 °C
FastDigest buffer = Zorgt ervoor dat de pH van de reactie (meestal 8.0) op peil blijft en zorgt voor een
goede omgeving voor de enzymen. Werkt deze buffer niet kunnen de restrictie enzymen niet
optimaal werken en zullen de restrictie enzymen ook niet tegelijk gaan knippen en dat het in één
reactie kan.
Mogelijke oorzaken problemen:
- Wel bandjes te zien maar verkeerd
o Waarschijnlijk niet bij de gel
o Door restrictie digestie zelf
Verkeerde restrictie enzymen
Verkeerde hoeveelheid DNA toegevoegd
Te weinig/geen buffer waardoor enzymen niet goed werken
Suboptimale condities
Belangrijk: Doordat de concentratie vrij hoog zal zijn van het DNA, zal niet alles geknipt worden. Dit
betekent dat er nog bandjes zichtbaar kunnen zijn bij 7024, wat gelijk staat aan ongeknipt.
1
, 2. Agarose gel elektroforese
Doel = PCR product visualiseren
DNA gel elektroforese is een techniek waar bij DNA moleculen worden gescheiden op basis van hun
grootte. Door het elektrische stimuleren van de DNA moleculen zullen ze richting het positieve deel
willen gaan (onderin) waarbij grotere moleculen langzamer bewegen dan kleinere moleculen.
Hoe hoger het percentage van je gel hoe langzamer de delen van je gel zullen runnen naar de
onderkant. Als je een te hoog percentage agarose in je gel hebt gedaan kan je hem voor een lagere
tijd runnen om te zorgen dat je toch goed je bandjes kan visualiseren. Hoe hoger je percentage van je
gel hoe kleiner de bandjes zijn die je kan visualiseren, dus hoe preciezer je gel is.
Hoe hoger je running voltage/microA hoe sneller het zal gaan. Laat je je gel te lang runnen dan zullen
alle samples uiteindelijk zakken tot de onderkant van je gel, dan kan je niks meer aflezen. Je doet een
high en low range ladder zodat je de grootte van de bandjes het beste kan bekijken.
Appearance Band _
Linear
B
Nicked (one the DNA-strands is broken)
A
Supercoiled (DNA is extra folded and thus
very compact)
C
+
Lineair DNA kan beter door de gel dan circulair DNA. Supercoiled DNA gaat soms wel sneller dan
lineair DNA, maar dit hoeft niet altijd zo te zijn.
Waarom midori green? -> Om de bandjes te visualiseren op je gel, anders hebben ze geen kleur.
Waarom loading dye? -> Geeft kleur aan de samples om ze te visualiseren en zorgt voor de loading
process. Daarnaast verhoogt het de dichtheid van je sample waardoor de samples goed runnen in je
gel. Is niet altijd nodig omdat de voornaamste functie is om de dichtheid van je sample te verhogen.
TAE buffer = Zorgt ervoor dat nucleaire zuren kunnen bewegen in de agarose mix. Het behoudt ook
de pH en ion concentraties tijdens de elektroforese.
2
, 3. Sanger Sequencing
Doel = Het bepalen van de basenparen volgorde van de verkregen mutatie
Vergeleken met de PCR gebruikt sanger sequencen niet alleen dNTPs, maar ook ddNTPs. Deze
hebben geen 3’ hydroxyl groep aan zich waardoor ze dus niet zorgen voor elongatie van het DNA
maar stoppen bij een bepaalde base.
Berekening primer
Hoeveelheid nodig = 7.5 pmol -> 7.5 x 10 -6 µmol (0.0000075
Concentratie = 5µM
Aantal µL nodig = 7.5 x 10- = 0.0000015 L = 1,5 µL
NR3C1 gen ->
- 17 transcripten
- Verdeeld over het genoom (chromosoom 5) en resulteren in verschillende eiwitten
- cDNA -> Eiwit coding
cDS -> eiwit coding
DNA: chromosoom GrCH
Coverage = In hoeverre twee stukken DNA dezelfde lengte hebben (exact evenveel basenparen =
100% coverage)
Lage coverage -> klein stuk DNA vergelijken
Hoge identity -> Je hebt een klein stuk maar die is wel exact hetzelfde als dat stuk van je
referentie
Identity = In hoeverre twee stukken DNA dezelfde nucleotide sequentie hebben (exact zelfde
sequentie = 100%)
4. PCR
Doel = Het vermeerderen van een DNA fragment van de hGR-EGFP
plasmide. Dit product wordt gevisualiseerd door middel van een
agarose gel.
De polymerase chain reaction wordt gebruikt om het DNA te
verlengen door thermocycling – cycli van temperatuurverschillen op
vaste tijdsintervallen. Je maakt gebruik van een thermostabiele DNA polymerase en kan door middel
van deoxynucleotides (dNTPs) meerdere kopieën van een DNA streng maken.
3
