FLOWCYTOMETRIE – ANALTYISCHE APPARATUUR EN MEETPRINCIPES
Te kennen:
- Definieer de term flowcytometrie
- Beschrijf welk type biologische staal het meest geschikt is voor een flowcytometrische
analyse
- Beschrijf welke kenmerken van een cel of partikel door een flowcytometer kunnen gemeten
worden (= optische vingerafdruk)
- Identificeer de 3 componenten (= hoofdonderdelen) van een flowcytometer (fluidica, optica
en electronica) en beschrijf hun respectievelijke functies
- Verklaar hydrodynamische focusering
- Beschrijf hoe lichtverstrooiing beïnvloed wordt door de kenmerken van een cel of partikel
- Beschrijf elastische en niet-elastische lichtverstrooiing
- Beschrijf het gebruik van excitatie-en emissiespectra
- Herken verschillende manieren om flowcytometrische data voor te stellen
Vakjargon:
Excitatie Proces waarbij optische energie geabsorbeerd wordt
Extinctie coëfficiënt - Efficiëntie waarmee optische energie geabsorbeerd wordt
/ is een grootheid die aangeeft in welke mate monochomatisch
licht wordt geabsorbeerd door de te onderzoeken stof
- Afhankelijk van golflengte/ temperatuur/ onderzochte stof
Emissie Proces waarbij optische energie terug vrijgesteld wordt
Quantum opbrengst - Efficiëntie waarmee energie wordt vrijgesteld (0-1), meestal als
fluorescentie
- Onafhankelijk van golflengte
Stokes shift Verschil in energie tussen excitatie en emissie golflengte max
Spectrum Verdeling van excitatie en emissie golflengtes
1. DEFINIEER DE TERM FLOWCYTOMETRIE:
- Flow: wat mogelijk is door de hydrodynamische focussering van de celsuspensiestroom in
een laminaire geleidingsvloeistofstroom
- Cyto: van afzonderlijke cellen doorheen het centrum van een, tot een microscopische kleine
spot gefocusseerde lichtstraal
- Metrie: detectie van lichtsignalen, opgewekt ten gevolge van de snelle doorgang
Kort, wat is flowcytometrie?
De flowcytometer focust door een laserstraal op afzonderlijke cellen te
richten terwijl deze door een ondervragingspunt stromen. Een "optische
vingerafdruk" wordt gegenereerd voor elke cel binnen een heterogene
populatie wanneer deze door de straal passeert. Wanneer cellen
worden gelabeld met fluorescerende probes, kunnen verschillende
parameters van elke cel tegelijkertijd worden bepaald. omdat de cellen
snel worden ondervraagd, kunnen gegevens en duizenden cellen in
seconden worden verkregen.
Detectie van lichtverstrooiingssignalen die opgewekt worden
door snelle passage van afzonderlijke cellen doorheen een
gefocusseerde lichtbundel (laser).
, 2. BESCHRIJF WELK TYPE BIOLOGISCHE STAAL HET MEEST GESCHIKT IS VOOR EEN
FLOWCYTOMETRISCHE ANALYSE
Elk partikel of cel in oplossing met een grootte van 0,2 – 150 micrometer is geschikt voor
flowcytometrische analyse.
Bepaalde cellen zijn uitermate geschikt voor flowcytometrie (bijvoorbeeld leukocyten in bloed want
deze bevinden zich al in een single cell suspensie) in tegenstelling tot solide tumoren en andere
weefsels (hier is eerst disaggregatie nodig om zo individuele cellen te verkrijgen).
Daarbij is een laminaire stroom noodzakelijk! (getal van Reynolds moet < 2300)
3. BESCHRIJF WELKE KENMERKEN VAN EEN CEL OF PARTIKEL DOOR EEN
FLOWCYTOMETER KUNNEN GEMETEN WORDEN (= OPTISCHE VINGERAFDRUK)
- De relatieve grootte van het partikel
- De relatieve interne complexiteit
- De relatieve fluorescentie intensiteit
4. IDENTIFICEER DE 3 COMPONENTEN (= HOOFDONDERDELEN) VAN EEN
FLOWCYTOMETER (FLUIDICA, OPTICA EN ELECTRONICA) EN BESCHRIJF HUN
RESPECTIEVELIJKE FUNCTIES
De apparatuur van de flowcytometer bestaat uit 3 gedeelten:
1) Fluidics oftewel vloeistofsysteem:
Het vloeistofsysteem transporteert het monster en stuurt de cellen één voor één langs de
lichtbron. De celsuspensie wordt geïnjecteerd in een vloeistofstroom, de zogenaamde “sheath
vloeistof”, die een laminaire laag rond het staal vormt en het staal zo concentreert. Door dit principe
van hydrodynamische focussering worden de cellen mooi achter elkaar gerangschikt waardoor zij
individueel de lichtbron in de flowcel kunnen passeren.
Transporteren naar de plaats waar ze door de laser worden bestraald, en zorgen ook voor
hydrodynamische focussering.
2) Optics oftewel optische systeem
Het optisch systeem bestaat uit een excitatie en een collectie gedeelte. Het excitatie gedeelte
omvat de lasers, lenzen en filters om het licht naar de flowcel te leiden. De lichtbron wordt onder een
hoek van 90 graden geplaats ten opzichte van de celsuspensiestroom. Wanneer de cellen door het
focuspunt van de laser gaan, zal het licht worden verstrooid en de eventuele aanwezige fluorchromen
werden aangestraald.
Het collectie gedeelte bestaat uit een set van lenzen, optische spiegels en filters. Door de
verschillende optische spiegels en filters wordt de lichtverstrooiing en de emissie-lichtpuls van de
verschillende fluorochromen opgesplitst in de verschillende relevante golflengtegebieden en naar de
Te kennen:
- Definieer de term flowcytometrie
- Beschrijf welk type biologische staal het meest geschikt is voor een flowcytometrische
analyse
- Beschrijf welke kenmerken van een cel of partikel door een flowcytometer kunnen gemeten
worden (= optische vingerafdruk)
- Identificeer de 3 componenten (= hoofdonderdelen) van een flowcytometer (fluidica, optica
en electronica) en beschrijf hun respectievelijke functies
- Verklaar hydrodynamische focusering
- Beschrijf hoe lichtverstrooiing beïnvloed wordt door de kenmerken van een cel of partikel
- Beschrijf elastische en niet-elastische lichtverstrooiing
- Beschrijf het gebruik van excitatie-en emissiespectra
- Herken verschillende manieren om flowcytometrische data voor te stellen
Vakjargon:
Excitatie Proces waarbij optische energie geabsorbeerd wordt
Extinctie coëfficiënt - Efficiëntie waarmee optische energie geabsorbeerd wordt
/ is een grootheid die aangeeft in welke mate monochomatisch
licht wordt geabsorbeerd door de te onderzoeken stof
- Afhankelijk van golflengte/ temperatuur/ onderzochte stof
Emissie Proces waarbij optische energie terug vrijgesteld wordt
Quantum opbrengst - Efficiëntie waarmee energie wordt vrijgesteld (0-1), meestal als
fluorescentie
- Onafhankelijk van golflengte
Stokes shift Verschil in energie tussen excitatie en emissie golflengte max
Spectrum Verdeling van excitatie en emissie golflengtes
1. DEFINIEER DE TERM FLOWCYTOMETRIE:
- Flow: wat mogelijk is door de hydrodynamische focussering van de celsuspensiestroom in
een laminaire geleidingsvloeistofstroom
- Cyto: van afzonderlijke cellen doorheen het centrum van een, tot een microscopische kleine
spot gefocusseerde lichtstraal
- Metrie: detectie van lichtsignalen, opgewekt ten gevolge van de snelle doorgang
Kort, wat is flowcytometrie?
De flowcytometer focust door een laserstraal op afzonderlijke cellen te
richten terwijl deze door een ondervragingspunt stromen. Een "optische
vingerafdruk" wordt gegenereerd voor elke cel binnen een heterogene
populatie wanneer deze door de straal passeert. Wanneer cellen
worden gelabeld met fluorescerende probes, kunnen verschillende
parameters van elke cel tegelijkertijd worden bepaald. omdat de cellen
snel worden ondervraagd, kunnen gegevens en duizenden cellen in
seconden worden verkregen.
Detectie van lichtverstrooiingssignalen die opgewekt worden
door snelle passage van afzonderlijke cellen doorheen een
gefocusseerde lichtbundel (laser).
, 2. BESCHRIJF WELK TYPE BIOLOGISCHE STAAL HET MEEST GESCHIKT IS VOOR EEN
FLOWCYTOMETRISCHE ANALYSE
Elk partikel of cel in oplossing met een grootte van 0,2 – 150 micrometer is geschikt voor
flowcytometrische analyse.
Bepaalde cellen zijn uitermate geschikt voor flowcytometrie (bijvoorbeeld leukocyten in bloed want
deze bevinden zich al in een single cell suspensie) in tegenstelling tot solide tumoren en andere
weefsels (hier is eerst disaggregatie nodig om zo individuele cellen te verkrijgen).
Daarbij is een laminaire stroom noodzakelijk! (getal van Reynolds moet < 2300)
3. BESCHRIJF WELKE KENMERKEN VAN EEN CEL OF PARTIKEL DOOR EEN
FLOWCYTOMETER KUNNEN GEMETEN WORDEN (= OPTISCHE VINGERAFDRUK)
- De relatieve grootte van het partikel
- De relatieve interne complexiteit
- De relatieve fluorescentie intensiteit
4. IDENTIFICEER DE 3 COMPONENTEN (= HOOFDONDERDELEN) VAN EEN
FLOWCYTOMETER (FLUIDICA, OPTICA EN ELECTRONICA) EN BESCHRIJF HUN
RESPECTIEVELIJKE FUNCTIES
De apparatuur van de flowcytometer bestaat uit 3 gedeelten:
1) Fluidics oftewel vloeistofsysteem:
Het vloeistofsysteem transporteert het monster en stuurt de cellen één voor één langs de
lichtbron. De celsuspensie wordt geïnjecteerd in een vloeistofstroom, de zogenaamde “sheath
vloeistof”, die een laminaire laag rond het staal vormt en het staal zo concentreert. Door dit principe
van hydrodynamische focussering worden de cellen mooi achter elkaar gerangschikt waardoor zij
individueel de lichtbron in de flowcel kunnen passeren.
Transporteren naar de plaats waar ze door de laser worden bestraald, en zorgen ook voor
hydrodynamische focussering.
2) Optics oftewel optische systeem
Het optisch systeem bestaat uit een excitatie en een collectie gedeelte. Het excitatie gedeelte
omvat de lasers, lenzen en filters om het licht naar de flowcel te leiden. De lichtbron wordt onder een
hoek van 90 graden geplaats ten opzichte van de celsuspensiestroom. Wanneer de cellen door het
focuspunt van de laser gaan, zal het licht worden verstrooid en de eventuele aanwezige fluorchromen
werden aangestraald.
Het collectie gedeelte bestaat uit een set van lenzen, optische spiegels en filters. Door de
verschillende optische spiegels en filters wordt de lichtverstrooiing en de emissie-lichtpuls van de
verschillende fluorochromen opgesplitst in de verschillende relevante golflengtegebieden en naar de
