Moleculaire Biologie P3-4
Nucleïnezuren extraheren & kwantificeren
Nucleïnezuren extraheren
Toepassingen van moleculaire diagnostiek:
Medische, forensische en voedselveiligheid
Medische toepassing
Microbiologie: detectie van virussen, bacteriën, parasieten.
- Klinische vraag: Is de patiënt besmet met X (met X een virus, bacterie of parasiet)?
Oncologie: genetische factors voor kankers opsporen-> tumors. Kan de prognose bepalen en
kan gebruikt worden voor de opvolging.
- Klinische vraag: Is de kanker teruggekeerd?
Genetische: bestuderen van genetische ziekten-> pre- en postnataal
- Klinische vraag: Heeft deze foetus trisomie?
Forensische toepassing
Identificatie van personen en vaderschapstesten
- Klinische vraag: Is de verdachte de dader, kom het DNA van de verdacht overeen met
die van de dader?
Voedselveiligheid
Opsporen van pathogenen.
- Klinische vraag: Is het voedsel besmet?
Stalen
Afhankelijk van de type analyse en klinische vraag.
- Wissers
- Perifeer bloed; WBC, cfDNA of ctDNA
- Beenmerg, CVS
- Urine/faeces
- Weefsel-> tumorweefsel
- Chorionvilli-> Vlokkentest-> stukjes van de placenta
- Amnionvocht-> vruchtwaterpunctie
DNA of RNA?
DNA is stabiel en RNA is vrij onstabiel. Dus bij voorkeur DNA, maar in bijzondere gevallen
RNA.
- RNA virussen-> door RT in cDNA
- Genexpressie-> tumor-> brengt hoge genexpressie i.v.m. normaal cel
- Translocaties-> oncologie-> ontstaan van fusiegenen-> opsporen van translocatie in
mRNA
,Procesflow
- Biopt fixeren met formaline en in een parafine blok plaatsen-> coupes
- DNA-extractie-> afhankelijk van toepassing is de opslag anders
- Kwantificeren-> voor verschillende technieken-> qPCR, PCR
Organische extractie:
- Enkel bij moeilijke stalen bv. bodemstalen
- Enzym toevoegen om cellen los te maken bv. proteinase K
- Lyse stap-> detergent dat cel gaan oplossen-> inhoud cel en kern komt los
- Organisch solvent toevoegen-> vortexen en centrifugeren
- Supernatans: DNA, tussen fase: proteïne en onderaan: lipiden
- Supernatans af pipeteren-> redelijk zuiver DNA
Chelex extractie:
- goedkope en simpele manier-> extract bevat veel onzuiverheden-> enkel PCR en geen
ingewikkelde technieken.
- Cellen in suspensie in een alkalische buffer-> Chelex toevoegen
- Opkoken-> cellen lyseren, EW denaturen en DNA komt vrij
- Chelex gaat divalente kationen binden-> inhibeert de daaropvolgende stappen
- Centrifugeren-> supernatans met DNA en chelex pellets met cel resten, EW en
divalente kationen
- Supernatans over gepipetteerd-> niet zuiver DNA en niet bruikbaar voor complexe
technieken.
- Chelex: polymeer bolletjes hebben 2 neg. ladingen die gaan binden aan divalente
kationen.
Solid phase extractie:
, - zuiver DNA-extractie.
- De vaste fase zijn paramagnetische beeds
- Kunnen binden aan DNA en worden aangetrokken door magneten.
- Kan ook met kolommen:
o Het cellysaat binden aan een kolom
o DNA bindt aan de kolom
o Elueren-> zuiver DNA-extract
o Belangrijk: veel zout aanwezig vanaf het begin-> chaotroop zout
DNA binden aan silicagel dmv zoutbruggen.
o Bij elutie geen zout-> breekt zoutbruggen
o DEAE-kolommen: diethylaminoethanol-kolom-> positieve lading dat kan
binden met DNA. Geen zoutbrug nodig. Voor elutie pH stijgen of zout
toevoegen.
RNA-extractie:
- Kolom en beeds aangepast zodat RNA kan binden.
- Altijd een stap met Dnase.
- Al het materiaal moet ook RNase vrij zijn.
- mRNA extractie:
o gebaseerd op het feit dat er een poly-A staart is.
o Een poly-T oligo T met biothine-> bindt met een magnetische beed gecoat
met striptovidine.
Nucleïnezuur kwantificeren
De kwantificatie technieken zijn niet allemaal even gevoelig, dit is afhankelijk van he type
staal en de toepassing. Zeer lage concentraties kunnen kwantificeren in kleine volumes.
Hoeveel DNA? Hoeveel RNA? Wat is de kwaliteit? Is het intact? Hoe zuiver is het?
Spectrofotometrie
Absorbantie van DNA max. bij 260nm. UV-spectrofotometer-> zeer kleine volumes.
Nucleïnezuren extraheren & kwantificeren
Nucleïnezuren extraheren
Toepassingen van moleculaire diagnostiek:
Medische, forensische en voedselveiligheid
Medische toepassing
Microbiologie: detectie van virussen, bacteriën, parasieten.
- Klinische vraag: Is de patiënt besmet met X (met X een virus, bacterie of parasiet)?
Oncologie: genetische factors voor kankers opsporen-> tumors. Kan de prognose bepalen en
kan gebruikt worden voor de opvolging.
- Klinische vraag: Is de kanker teruggekeerd?
Genetische: bestuderen van genetische ziekten-> pre- en postnataal
- Klinische vraag: Heeft deze foetus trisomie?
Forensische toepassing
Identificatie van personen en vaderschapstesten
- Klinische vraag: Is de verdachte de dader, kom het DNA van de verdacht overeen met
die van de dader?
Voedselveiligheid
Opsporen van pathogenen.
- Klinische vraag: Is het voedsel besmet?
Stalen
Afhankelijk van de type analyse en klinische vraag.
- Wissers
- Perifeer bloed; WBC, cfDNA of ctDNA
- Beenmerg, CVS
- Urine/faeces
- Weefsel-> tumorweefsel
- Chorionvilli-> Vlokkentest-> stukjes van de placenta
- Amnionvocht-> vruchtwaterpunctie
DNA of RNA?
DNA is stabiel en RNA is vrij onstabiel. Dus bij voorkeur DNA, maar in bijzondere gevallen
RNA.
- RNA virussen-> door RT in cDNA
- Genexpressie-> tumor-> brengt hoge genexpressie i.v.m. normaal cel
- Translocaties-> oncologie-> ontstaan van fusiegenen-> opsporen van translocatie in
mRNA
,Procesflow
- Biopt fixeren met formaline en in een parafine blok plaatsen-> coupes
- DNA-extractie-> afhankelijk van toepassing is de opslag anders
- Kwantificeren-> voor verschillende technieken-> qPCR, PCR
Organische extractie:
- Enkel bij moeilijke stalen bv. bodemstalen
- Enzym toevoegen om cellen los te maken bv. proteinase K
- Lyse stap-> detergent dat cel gaan oplossen-> inhoud cel en kern komt los
- Organisch solvent toevoegen-> vortexen en centrifugeren
- Supernatans: DNA, tussen fase: proteïne en onderaan: lipiden
- Supernatans af pipeteren-> redelijk zuiver DNA
Chelex extractie:
- goedkope en simpele manier-> extract bevat veel onzuiverheden-> enkel PCR en geen
ingewikkelde technieken.
- Cellen in suspensie in een alkalische buffer-> Chelex toevoegen
- Opkoken-> cellen lyseren, EW denaturen en DNA komt vrij
- Chelex gaat divalente kationen binden-> inhibeert de daaropvolgende stappen
- Centrifugeren-> supernatans met DNA en chelex pellets met cel resten, EW en
divalente kationen
- Supernatans over gepipetteerd-> niet zuiver DNA en niet bruikbaar voor complexe
technieken.
- Chelex: polymeer bolletjes hebben 2 neg. ladingen die gaan binden aan divalente
kationen.
Solid phase extractie:
, - zuiver DNA-extractie.
- De vaste fase zijn paramagnetische beeds
- Kunnen binden aan DNA en worden aangetrokken door magneten.
- Kan ook met kolommen:
o Het cellysaat binden aan een kolom
o DNA bindt aan de kolom
o Elueren-> zuiver DNA-extract
o Belangrijk: veel zout aanwezig vanaf het begin-> chaotroop zout
DNA binden aan silicagel dmv zoutbruggen.
o Bij elutie geen zout-> breekt zoutbruggen
o DEAE-kolommen: diethylaminoethanol-kolom-> positieve lading dat kan
binden met DNA. Geen zoutbrug nodig. Voor elutie pH stijgen of zout
toevoegen.
RNA-extractie:
- Kolom en beeds aangepast zodat RNA kan binden.
- Altijd een stap met Dnase.
- Al het materiaal moet ook RNase vrij zijn.
- mRNA extractie:
o gebaseerd op het feit dat er een poly-A staart is.
o Een poly-T oligo T met biothine-> bindt met een magnetische beed gecoat
met striptovidine.
Nucleïnezuur kwantificeren
De kwantificatie technieken zijn niet allemaal even gevoelig, dit is afhankelijk van he type
staal en de toepassing. Zeer lage concentraties kunnen kwantificeren in kleine volumes.
Hoeveel DNA? Hoeveel RNA? Wat is de kwaliteit? Is het intact? Hoe zuiver is het?
Spectrofotometrie
Absorbantie van DNA max. bij 260nm. UV-spectrofotometer-> zeer kleine volumes.
