Hoofdstuk 1: Biochemische analyse; analytische performantie, kwaliteitscontrole en
kalibratie
1.1 Analytische performantie
Er zijn enkele parameters die bepalen of je onderzoek goed is:
Aard van de analyse:
- Kwalitatieve analyse= identificatie, detectie of aantonen van bestanddelen in een monster
- Kwantitatieve analyse= verkrijgen van informatie over de relatieve hoeveelheid (conc.) van
één, meerdere (partiële analyse) of alle bestanddelen (totaalanalyse) aanwezig in de te
analyseren materie.
→ Hierbij kan verder onderscheid gemaakt worden tussen individuele analyse (van één
specifieke component, vb. glucose in serum) en groepsanalyse (van een aantal verwante
componenten, vb totaal eiwitgehalte in serum – kalibratie)
Opm. Kwantitatieve analyse is gebaseerd op meting v/e fysico-chemische grootheid die
(on)rechtstreeks evenredig is met de hoeveelheid te doseren bestanddeel:
- Volume, gewicht
- Stroomsterkte, potentiaal, geleidbaarheid …
- Massa
- Radioactiviteit
- Lichtabsorptie/-emissie/-fluorescentie
Specificiteit vs selectiviteit
- Specificiteit: Een reactie is specifiek, wanneer ze alleen maar opgaat met het bestanddeel
dat men wenst te doseren
- Selectiviteit: Een test is selectief wanneer hij een bepaalde, maar geen absolute voorkeur
vertoont voor het te doseren bestanddeel maar ook positief kan reageren met andere
componenten
=== Finaal dient de ideale test 100% specifiek te zijn (= het geregistreerde signaal is alleen
afkomstig van het analyt)(als je aluminium wil zoeken in een staal dan wil je enkel dit bepalen)
Opm. Specificiteit van een test kan verbeterd worden door aanpassen van parameters:
pH, complexvorming, temperatuur, oxidatiegraad, voorafgaande eliminatie van interfererende
factoren ....
Gevoeligheid/sensitiviteit:
De gevoeligheid van een methode wordt bepaald door de
helling van de ijkcurve;
= meetsignaal vs. de concentratie
Gevoeligheid = gemeten signaal/concentratie
= signaal per eenheidsconcentratie
,Karakteristieke concentratie:
→ Voor bepaalde technieken wordt de karakteristieke concentratie als maat voor gevoeligheid
gebruikt
= de hoeveelheid (µg = 10-6 g) van de te bepalen stof die een absorbantie van 0.0044
(= 1% absorptie) teweegbrengt.
Eenheid: µg/ml/1% Abs of µg/g/1% Abs
Detectielimiet vs kwantificatielimiet
Detectielimiet / limit of detection (LOD)
= de minimale concentratie van de te bepalen stof die in staat is een signaal te veroorzaken dat het
dubbel is van het achtergrondsignaal (peak to peak noise)
= concentratie die zorgt voor een signaal/ruis verhouding (S/N = signal-noise ratio) van 2
Opm. Soms wordt ook de formule 3 x SD* blank signaal gebruikt
Functie: LOD is van groter analytisch belang dan de gevoeligheid omdat naast de signaalgrootte
ook het achtergrondsignaal in rekening wordt gebracht (LOD ≠ 𝑔𝑒𝑣𝑜𝑒𝑙𝑖𝑔ℎ𝑒𝑖𝑑)
Kwantificatielimiet / limit of quantification (LOQ)
= laagste concentratie van de te bepalen stof die kwantitatief kan worden bepaald
Formule: 10 x SD blank signaal
Detectielimiet Sensitiviteit vs detectielimiet
Blancobepaling
bepaling van de fractie van het totaalsignaal dat niet te wijten is aan het te doseren bestanddeel in
het te analyseren staal
Accuraatheid
= maat voor afwijking van het experimenteel gevonden analyseresultaat ten opzichte van de
onbekende werkelijke waarde
Hoe? Men stelt bepaalde eisen aan de accuraatheid bv: maximale afwijking: 5%
Werking: Om de accuraatheid v/e analysemethode te bepalen kan men zich baseren op het
analyseren van met certificaat voorziene standaardmonsters afgeleverd door standaardinstituten
Fout? Een indirecte benadering van de accuraatheid bestaat erin de recovery van een gekende
hoeveelheid geaddeerde te meten substantie te bepalen
Precisie
,= maat voor de reproduceerbaarheid van de analyseresultaten, maat voor precisie...
- Intra-variatiecoëfficiënt= gemiddelde afwijking t.o.v. het gemiddelde tijdens een en dezelfde
analytische run (= onder dezelfde condities (within-run precision of repeatability))
- Inter-variatiecoëfficiënt: de gemiddelde afwijking t.o.v. het gemiddelde bij verschillende runs
(= onder veranderde condities, vb van dag tot dag, verschillende operatoren (between-run
precision of reproducibility))
- De variatiecoëfficiënt (VC) = standaarddeviatie (SD) van de verschillende metingen van
hetzelfde staal/gemiddelde waarde (µ) v/d verschillende metingen v/h staal (VC = SD/µ)
⇒ De VC reflecteert de imprecisie
Opm. intervariatiecoëfficiënt is belangrijker dan de intravariatiecoëfficiënt
MAAR: Een goede precisie impliceert niet automatisch een goede accuraatheid !!!
→ Het is belangrijk zowel precisie als accuraatheid van een analytische methode te
bepalen bij verschillende concentraties
Concentratie van een bestanddeel, SD en VC*:
De situatie van de middelste grafiek
is optimaal, deze resulteert in een
constante VC als je de SD ziet
veranderen met veranderende
concentratie
De andere situaties zijn minder
voordelig
LOL= limit of linearity, het signaal dat je krijgt is niet altijd lineair
naarmate je proef vordert, deze buigt vaak af (door verzadiging
bijvoorbeeld)
alle parameters worden grafisch voorgesteld in één grafiek
Belangrijk in een onderzoek zijn dus:
Kwalitatief vs kwantitatief, Specificiteit, selectiviteit, sensitiviteit,
karakteristieke concentratie, detectielimiet, kwantificatielimiet,
accuraatheid, precisie, variatiecoëfficiënt
, 1.2 Kwaliteitscontrole van biochemische analyse
Het is belangrijk dat er interne en externe kwaliteitscontrole wordt gedaan
Interne kwaliteitscontrole:
Grafiek 1:
1) Je hebt een staal met een gekende concentratie
2) je meet dit op verschillende tijdstippen
3) je stelt in wat de afwijking mag zijn ten opzichte van het gemiddelde,
deze wordt afgebakend door een minimum- en maximum
4) we doen een aantal analyses
5) Je ziet dan op de onderste grafiek dat alle metingen tussen min-max
liggen (altijd dicht bij het gemiddelde) (zie Gauss-curve)
Grafiek 2:
1) Je ziet dat alle metingen dicht bij elkaar liggen maar dat ze
vooral dicht bij de onderste limiet liggen
2) dit betekent dat er iets fout zal zijn met de methode
3) we moeten de shift naar onder corrigeren
Grafiek 3:
1) Je ziet grote onderlinge afwijkingen bij alle metingen
2) Je bekomt wel een gauss curve maar de ‘’uitschieters”
liggen wel buiten de min-max-limieten
3) wel een goede accuraatheid, geen goede precisie
Externe kwaliteitscontrole: external quality assessment programs
(University of Guildford (UK))
1) De labo’s die hieraan deelnemen krijgen stalen opgestuurd vanuit het controlelabo
= 3 stalen/maand met ongekende conc. v/d te analyseren compound gedurende 6 maand
2) Ieder staal wordt 2x toegestuurd op ongekende tijdstippen
3) Je krijgt dan een zesmaandelijks rapport
4) Zo kan je dus via de externe quality check je accuraatheid gaan achterhalen (want het
controlelabo weet exact hoeveel er van elke compound aanwezig is), door vergelijking van
de twee resultaten van de inzending kan je ook de precisie te weten komen
Analytische performantie op basis van:
- Recovery geaddeerde compound = maat voor accuraatheid
- Afwijking tov het consensus gemiddelde (= gemiddelde alle deelnemende laboratoria)
= maat voor accuraatheid
- Verschil tussen in duplo analyses = maat voor precisie
Voorbeeld van een aantal laboratoria die meedoen
Opm. als je als labo hieraan meedoet dan heb je wel goed geloof in
je kunnen want dan wil je aan de andere labo’s laten zien dat je goed
bezig bent met accuraatheid en precisie, de controle is volledig
vrijblijvend
Opm. je kan deelnemen aan deze controles voor vanalles,
bloedonderzoek, organische verbindingen
kalibratie
1.1 Analytische performantie
Er zijn enkele parameters die bepalen of je onderzoek goed is:
Aard van de analyse:
- Kwalitatieve analyse= identificatie, detectie of aantonen van bestanddelen in een monster
- Kwantitatieve analyse= verkrijgen van informatie over de relatieve hoeveelheid (conc.) van
één, meerdere (partiële analyse) of alle bestanddelen (totaalanalyse) aanwezig in de te
analyseren materie.
→ Hierbij kan verder onderscheid gemaakt worden tussen individuele analyse (van één
specifieke component, vb. glucose in serum) en groepsanalyse (van een aantal verwante
componenten, vb totaal eiwitgehalte in serum – kalibratie)
Opm. Kwantitatieve analyse is gebaseerd op meting v/e fysico-chemische grootheid die
(on)rechtstreeks evenredig is met de hoeveelheid te doseren bestanddeel:
- Volume, gewicht
- Stroomsterkte, potentiaal, geleidbaarheid …
- Massa
- Radioactiviteit
- Lichtabsorptie/-emissie/-fluorescentie
Specificiteit vs selectiviteit
- Specificiteit: Een reactie is specifiek, wanneer ze alleen maar opgaat met het bestanddeel
dat men wenst te doseren
- Selectiviteit: Een test is selectief wanneer hij een bepaalde, maar geen absolute voorkeur
vertoont voor het te doseren bestanddeel maar ook positief kan reageren met andere
componenten
=== Finaal dient de ideale test 100% specifiek te zijn (= het geregistreerde signaal is alleen
afkomstig van het analyt)(als je aluminium wil zoeken in een staal dan wil je enkel dit bepalen)
Opm. Specificiteit van een test kan verbeterd worden door aanpassen van parameters:
pH, complexvorming, temperatuur, oxidatiegraad, voorafgaande eliminatie van interfererende
factoren ....
Gevoeligheid/sensitiviteit:
De gevoeligheid van een methode wordt bepaald door de
helling van de ijkcurve;
= meetsignaal vs. de concentratie
Gevoeligheid = gemeten signaal/concentratie
= signaal per eenheidsconcentratie
,Karakteristieke concentratie:
→ Voor bepaalde technieken wordt de karakteristieke concentratie als maat voor gevoeligheid
gebruikt
= de hoeveelheid (µg = 10-6 g) van de te bepalen stof die een absorbantie van 0.0044
(= 1% absorptie) teweegbrengt.
Eenheid: µg/ml/1% Abs of µg/g/1% Abs
Detectielimiet vs kwantificatielimiet
Detectielimiet / limit of detection (LOD)
= de minimale concentratie van de te bepalen stof die in staat is een signaal te veroorzaken dat het
dubbel is van het achtergrondsignaal (peak to peak noise)
= concentratie die zorgt voor een signaal/ruis verhouding (S/N = signal-noise ratio) van 2
Opm. Soms wordt ook de formule 3 x SD* blank signaal gebruikt
Functie: LOD is van groter analytisch belang dan de gevoeligheid omdat naast de signaalgrootte
ook het achtergrondsignaal in rekening wordt gebracht (LOD ≠ 𝑔𝑒𝑣𝑜𝑒𝑙𝑖𝑔ℎ𝑒𝑖𝑑)
Kwantificatielimiet / limit of quantification (LOQ)
= laagste concentratie van de te bepalen stof die kwantitatief kan worden bepaald
Formule: 10 x SD blank signaal
Detectielimiet Sensitiviteit vs detectielimiet
Blancobepaling
bepaling van de fractie van het totaalsignaal dat niet te wijten is aan het te doseren bestanddeel in
het te analyseren staal
Accuraatheid
= maat voor afwijking van het experimenteel gevonden analyseresultaat ten opzichte van de
onbekende werkelijke waarde
Hoe? Men stelt bepaalde eisen aan de accuraatheid bv: maximale afwijking: 5%
Werking: Om de accuraatheid v/e analysemethode te bepalen kan men zich baseren op het
analyseren van met certificaat voorziene standaardmonsters afgeleverd door standaardinstituten
Fout? Een indirecte benadering van de accuraatheid bestaat erin de recovery van een gekende
hoeveelheid geaddeerde te meten substantie te bepalen
Precisie
,= maat voor de reproduceerbaarheid van de analyseresultaten, maat voor precisie...
- Intra-variatiecoëfficiënt= gemiddelde afwijking t.o.v. het gemiddelde tijdens een en dezelfde
analytische run (= onder dezelfde condities (within-run precision of repeatability))
- Inter-variatiecoëfficiënt: de gemiddelde afwijking t.o.v. het gemiddelde bij verschillende runs
(= onder veranderde condities, vb van dag tot dag, verschillende operatoren (between-run
precision of reproducibility))
- De variatiecoëfficiënt (VC) = standaarddeviatie (SD) van de verschillende metingen van
hetzelfde staal/gemiddelde waarde (µ) v/d verschillende metingen v/h staal (VC = SD/µ)
⇒ De VC reflecteert de imprecisie
Opm. intervariatiecoëfficiënt is belangrijker dan de intravariatiecoëfficiënt
MAAR: Een goede precisie impliceert niet automatisch een goede accuraatheid !!!
→ Het is belangrijk zowel precisie als accuraatheid van een analytische methode te
bepalen bij verschillende concentraties
Concentratie van een bestanddeel, SD en VC*:
De situatie van de middelste grafiek
is optimaal, deze resulteert in een
constante VC als je de SD ziet
veranderen met veranderende
concentratie
De andere situaties zijn minder
voordelig
LOL= limit of linearity, het signaal dat je krijgt is niet altijd lineair
naarmate je proef vordert, deze buigt vaak af (door verzadiging
bijvoorbeeld)
alle parameters worden grafisch voorgesteld in één grafiek
Belangrijk in een onderzoek zijn dus:
Kwalitatief vs kwantitatief, Specificiteit, selectiviteit, sensitiviteit,
karakteristieke concentratie, detectielimiet, kwantificatielimiet,
accuraatheid, precisie, variatiecoëfficiënt
, 1.2 Kwaliteitscontrole van biochemische analyse
Het is belangrijk dat er interne en externe kwaliteitscontrole wordt gedaan
Interne kwaliteitscontrole:
Grafiek 1:
1) Je hebt een staal met een gekende concentratie
2) je meet dit op verschillende tijdstippen
3) je stelt in wat de afwijking mag zijn ten opzichte van het gemiddelde,
deze wordt afgebakend door een minimum- en maximum
4) we doen een aantal analyses
5) Je ziet dan op de onderste grafiek dat alle metingen tussen min-max
liggen (altijd dicht bij het gemiddelde) (zie Gauss-curve)
Grafiek 2:
1) Je ziet dat alle metingen dicht bij elkaar liggen maar dat ze
vooral dicht bij de onderste limiet liggen
2) dit betekent dat er iets fout zal zijn met de methode
3) we moeten de shift naar onder corrigeren
Grafiek 3:
1) Je ziet grote onderlinge afwijkingen bij alle metingen
2) Je bekomt wel een gauss curve maar de ‘’uitschieters”
liggen wel buiten de min-max-limieten
3) wel een goede accuraatheid, geen goede precisie
Externe kwaliteitscontrole: external quality assessment programs
(University of Guildford (UK))
1) De labo’s die hieraan deelnemen krijgen stalen opgestuurd vanuit het controlelabo
= 3 stalen/maand met ongekende conc. v/d te analyseren compound gedurende 6 maand
2) Ieder staal wordt 2x toegestuurd op ongekende tijdstippen
3) Je krijgt dan een zesmaandelijks rapport
4) Zo kan je dus via de externe quality check je accuraatheid gaan achterhalen (want het
controlelabo weet exact hoeveel er van elke compound aanwezig is), door vergelijking van
de twee resultaten van de inzending kan je ook de precisie te weten komen
Analytische performantie op basis van:
- Recovery geaddeerde compound = maat voor accuraatheid
- Afwijking tov het consensus gemiddelde (= gemiddelde alle deelnemende laboratoria)
= maat voor accuraatheid
- Verschil tussen in duplo analyses = maat voor precisie
Voorbeeld van een aantal laboratoria die meedoen
Opm. als je als labo hieraan meedoet dan heb je wel goed geloof in
je kunnen want dan wil je aan de andere labo’s laten zien dat je goed
bezig bent met accuraatheid en precisie, de controle is volledig
vrijblijvend
Opm. je kan deelnemen aan deze controles voor vanalles,
bloedonderzoek, organische verbindingen
