Opdracht 1 (RNA-isolatie)
A. mRNA zegt iets over hoe het eiwit tot expressie komt, dit zegt het Bcr-Abl ook daadwerkelijk tot
expressie komt in het monster. DNA zegt alleen of het aanwezig is, maar niet of het ook tot expressie
komt.
B. Guanidinium Thiocyanate is een RNAse-remmer. Na het homogeniseren van het monster met
TRIzol®-reagens, chloroform wordt toegevoegd en het homogenaat is toegestaan
scheiden in een heldere bovenste waterige laag, een interfase en een rode/blauwe
onderste organische laag. RNA wordt uit de waterige laag geprecipiteerd (=neerslaan) met
isopropanol. Het geprecipiteerde RNA wordt gewassen om onzuiverheden te verwijderen, en
vervolgens opnieuw gesuspendeerd voor gebruik in downstream-toepassingen.
C. in de foto zijn 3 bandjes zichtbaar, (van boven naar beneden) 1. Is achtergebleven DNA, 2 is 28S
rRNA en 3 is 18S rRNA. Dit betekend dat het monster inderdaad RNA bevat, maar ook nog bevuilt
met gDNA. Het monster is dus niet helemaal zuiver. (een extra DNAse stap zou de oplossing kunnen
bieden).
Extra vragen/uitleg over onderwerp
• Wat betekent RNA?
- Ribonucleïnezuur
• Hoe ziet een RNA-monomeer er uit (globaal)?
- Enkelstrengs, fosfaat- en suikergroep& base (AUCA)
• Welke soorten RNA zijn er?
- tRNA, mRNA, rRNA (siRNA en miRNA)
• Waarom isoleer je RNA?
- Kijken naar gen expressie
• Wat doet RNAse?
- Breekt RNA af
Trizol,
Guanidinium isothiocyanate (powerful proteine denaturant) inactiveert RNase
(zuur) phonol/chloroform verdeling van RNA in waterige (supernatant) scheiding.
*note: lage pH is cruciaal, doordat bij neutrale pH het DNA juist in de waterige fase komt, en bij te
hoge denatureert het DNA!
rRNA is zichtbaar op een gel voor controle ‘’eerste’’ bandje (helemaal bovenin) gDNA (dit toont
aan op besmetting), 2e bandjes 28S rRNA en 3e bandje 18 rRNA (zo kun je zien of er RNA is geisoleerd
en of er geen besmetting in zit)
, Geef een flowchart weer van de MRD proef.
Dag 1:
- cellen tellen met telkamer
- IJklijn pipetteren.
- RNA isolatie m.b.v. TRIzol Reagent.
- Concentratie en zuiverheid bepalen met nanodrop
- Kwaliteit RNA bepalen met agaorse gel
Dag 2:
- cDNA synthese m.b.v. M-MLV RT door middel van RT-PCR.
- Real-time PCR met SYBR green en primers tegen BCR-ABl en GAPDH.
- Uitwerken met de Pfaffl methode.
nanodrop kan ook gedaan worden voor zuiverheid bij NM:
- 230: verontreiniging van organische stoffen
- 260: DNA/RNA meting
- 280: verontreiniging met eiwitten
- 320 ‘’ achtergrond’’
De A260/A280 ratio: meet je de zuiverheid van je RNA/DNA (ideaal bij 1,8-2,2). Deze ratio kan
beïnvloed worden door: verhoogd pH, lage 280 (dus verontreiniging met eiwitten), maar gelijke 260.
Je meet bij een 260/280 niet alleen RNA, je meet adenine (A) dus ook DNA! (dit is ook waarom je na
cDNA synthese geen nanodrop doet (omdat je ook toegevoegde DNTP’s meet) )
*je doet dus een nanodrop na RNA isolatie!
One-step en two-stap
1-stap: gebruik van sequentie-specifieke primers, zowel RT als DNA polymerase (qPCR) is
tegelijkertijd aanwezig tijdens reverse transcriptie(RT en qPCR gebeuren als ware tegelijkertijd).
Voordeel hiervan is:
- Minder contaminatie
- Minder pipetteer stappen (minder fouten)
- Hoge sensitiviteit,
Nadeel:
- Verhoogde kans op primer-dimer (= forward en reverse primer binden aan elkaar ipv aan
het RNA/target)
- All or nothing, volledige sample wordt verbruikt. Bij mislukken betekend het dat al het
monster weg is.
2-stap: Reverse transcriptase wordt uitgevoerd in een buffer geoptimaliseerd (met random en/of
oligo dT primers) voor reverse transcriptase. Er wordt maar deel van het verkregen cDNA
overgebracht voor qPCR (qPCR gebruikt eigen specifieke primers)
Voordelen:
- Er wordt meer cDNA verkregen, waardoor meerdere qPCR uitgevoerd zou kunnen
worden indien na failen bv (of voor ander onderzoek).
- Sensitiviteit is hoger in 2-stap dan 1-stap (door de gebruikte buffer)
- Je kunt meerdere ‘’targets’’ verkrijgen van 1 RNA sample (door non-specifieke primers)
A. mRNA zegt iets over hoe het eiwit tot expressie komt, dit zegt het Bcr-Abl ook daadwerkelijk tot
expressie komt in het monster. DNA zegt alleen of het aanwezig is, maar niet of het ook tot expressie
komt.
B. Guanidinium Thiocyanate is een RNAse-remmer. Na het homogeniseren van het monster met
TRIzol®-reagens, chloroform wordt toegevoegd en het homogenaat is toegestaan
scheiden in een heldere bovenste waterige laag, een interfase en een rode/blauwe
onderste organische laag. RNA wordt uit de waterige laag geprecipiteerd (=neerslaan) met
isopropanol. Het geprecipiteerde RNA wordt gewassen om onzuiverheden te verwijderen, en
vervolgens opnieuw gesuspendeerd voor gebruik in downstream-toepassingen.
C. in de foto zijn 3 bandjes zichtbaar, (van boven naar beneden) 1. Is achtergebleven DNA, 2 is 28S
rRNA en 3 is 18S rRNA. Dit betekend dat het monster inderdaad RNA bevat, maar ook nog bevuilt
met gDNA. Het monster is dus niet helemaal zuiver. (een extra DNAse stap zou de oplossing kunnen
bieden).
Extra vragen/uitleg over onderwerp
• Wat betekent RNA?
- Ribonucleïnezuur
• Hoe ziet een RNA-monomeer er uit (globaal)?
- Enkelstrengs, fosfaat- en suikergroep& base (AUCA)
• Welke soorten RNA zijn er?
- tRNA, mRNA, rRNA (siRNA en miRNA)
• Waarom isoleer je RNA?
- Kijken naar gen expressie
• Wat doet RNAse?
- Breekt RNA af
Trizol,
Guanidinium isothiocyanate (powerful proteine denaturant) inactiveert RNase
(zuur) phonol/chloroform verdeling van RNA in waterige (supernatant) scheiding.
*note: lage pH is cruciaal, doordat bij neutrale pH het DNA juist in de waterige fase komt, en bij te
hoge denatureert het DNA!
rRNA is zichtbaar op een gel voor controle ‘’eerste’’ bandje (helemaal bovenin) gDNA (dit toont
aan op besmetting), 2e bandjes 28S rRNA en 3e bandje 18 rRNA (zo kun je zien of er RNA is geisoleerd
en of er geen besmetting in zit)
, Geef een flowchart weer van de MRD proef.
Dag 1:
- cellen tellen met telkamer
- IJklijn pipetteren.
- RNA isolatie m.b.v. TRIzol Reagent.
- Concentratie en zuiverheid bepalen met nanodrop
- Kwaliteit RNA bepalen met agaorse gel
Dag 2:
- cDNA synthese m.b.v. M-MLV RT door middel van RT-PCR.
- Real-time PCR met SYBR green en primers tegen BCR-ABl en GAPDH.
- Uitwerken met de Pfaffl methode.
nanodrop kan ook gedaan worden voor zuiverheid bij NM:
- 230: verontreiniging van organische stoffen
- 260: DNA/RNA meting
- 280: verontreiniging met eiwitten
- 320 ‘’ achtergrond’’
De A260/A280 ratio: meet je de zuiverheid van je RNA/DNA (ideaal bij 1,8-2,2). Deze ratio kan
beïnvloed worden door: verhoogd pH, lage 280 (dus verontreiniging met eiwitten), maar gelijke 260.
Je meet bij een 260/280 niet alleen RNA, je meet adenine (A) dus ook DNA! (dit is ook waarom je na
cDNA synthese geen nanodrop doet (omdat je ook toegevoegde DNTP’s meet) )
*je doet dus een nanodrop na RNA isolatie!
One-step en two-stap
1-stap: gebruik van sequentie-specifieke primers, zowel RT als DNA polymerase (qPCR) is
tegelijkertijd aanwezig tijdens reverse transcriptie(RT en qPCR gebeuren als ware tegelijkertijd).
Voordeel hiervan is:
- Minder contaminatie
- Minder pipetteer stappen (minder fouten)
- Hoge sensitiviteit,
Nadeel:
- Verhoogde kans op primer-dimer (= forward en reverse primer binden aan elkaar ipv aan
het RNA/target)
- All or nothing, volledige sample wordt verbruikt. Bij mislukken betekend het dat al het
monster weg is.
2-stap: Reverse transcriptase wordt uitgevoerd in een buffer geoptimaliseerd (met random en/of
oligo dT primers) voor reverse transcriptase. Er wordt maar deel van het verkregen cDNA
overgebracht voor qPCR (qPCR gebruikt eigen specifieke primers)
Voordelen:
- Er wordt meer cDNA verkregen, waardoor meerdere qPCR uitgevoerd zou kunnen
worden indien na failen bv (of voor ander onderzoek).
- Sensitiviteit is hoger in 2-stap dan 1-stap (door de gebruikte buffer)
- Je kunt meerdere ‘’targets’’ verkrijgen van 1 RNA sample (door non-specifieke primers)
