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Práctica 6. Aislamiento de plásmido y Digestión con enzimas
de restricción
Bioquímica Experimental (Universidad Nacional Autónoma de México)
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, lOMoARcPSD|11700591
0141-Bioquímica Experimental________ Facultad de Química
Grupo 6 ● Ago-Nov (2018-1) ● Optativa Disciplinaria
Tipo: Experimental ● 6 créditos L-307 / Edificio B
● Lun 4:00-6:00 p.m. y Mie 4:00-8:00 p.m.
Profesores: Dr. Euclides Ávila Chávez y Dra. Carmen Adriana Mendoza Rodríguez
Purificación y ensayo de restricción del plásmido recombinante
pET-TEM1-ompAβ-lactamasa
en células transformantes de E. coli BL21 (DE3)
Por: Gutiérrez Silvestre Jessica / Durán Iturbide Noemí Ángeles / Carrasco Mote Leonardo
Depto. Bioquímica, Facultad de Química, UNAM.
Circuito Exterior S/N, Copilco El Bajo, Cd. Universitaria. 04510 Coyoacán, México, Ciudad de México, CDMX.
Correo de correspondencia:
RESUMEN
Se empleó el método de lisis alcalina, donde se lisan las membranas de las células mediante un
detergente SDS y un choque alcalino con NaOH y se precipita el plásmido recombinante con
isopropanol, para luego digerirlo con enzimas de restricción BamHI y NdeI debido a que el vector
utilizado en la transformación tiene dos sitios de restricción para enzimas diferentes de manera que
cortando con estas dos enzimas se libera sólo el fragmento de interés; se procedió a cargar en un gel de
agarosa al 1% teñido con EtBr y se observó con respecto a un marcador de tamaño molecular del
bacteriófago lambda digerido con HindIII. En los resultados se muestran 3 carriles con diferentes pesos
moleculares, correspondientes a: el plásmido híbrido~6456 p.b., otro fragmento con peso molecular
que corresponde al plásmido digerido con las 2 enzimas de ~5370 p.b. y un fragmento de peso
molecular de ~1284 p.b. (inserto).
Palabras clave: Endonucleasas-enzimas de restricción provenientes de Eubacterias y Arqueas.
BamHI: enzima de restricción descubierta en Bacillus amyloliquefaciens. NdeI: enzima de restricción
aislada de Neisseria denitrificans. p.b.: pares de bases.
INTRODUCCIÓN
se pueden insertar u obtener utilizando enzimas
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN
de restricción (usualmente las de tipo II). Para
circular que se replican de manera autónoma en
asegurar que las bacterias transformadas poseen
procariontes. Debido a su capacidad de
el vector recombinante con la secuencia de
replicarse rápidamente, se utilizan como
interés se utiliza una técnica de monitoreo
vectores de clonación de genes de interés, el cual
genotípico: aislamiento de plásmido y
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Práctica 6. Aislamiento de plásmido y Digestión con enzimas
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Grupo 6 ● Ago-Nov (2018-1) ● Optativa Disciplinaria
Tipo: Experimental ● 6 créditos L-307 / Edificio B
● Lun 4:00-6:00 p.m. y Mie 4:00-8:00 p.m.
Profesores: Dr. Euclides Ávila Chávez y Dra. Carmen Adriana Mendoza Rodríguez
Purificación y ensayo de restricción del plásmido recombinante
pET-TEM1-ompAβ-lactamasa
en células transformantes de E. coli BL21 (DE3)
Por: Gutiérrez Silvestre Jessica / Durán Iturbide Noemí Ángeles / Carrasco Mote Leonardo
Depto. Bioquímica, Facultad de Química, UNAM.
Circuito Exterior S/N, Copilco El Bajo, Cd. Universitaria. 04510 Coyoacán, México, Ciudad de México, CDMX.
Correo de correspondencia:
RESUMEN
Se empleó el método de lisis alcalina, donde se lisan las membranas de las células mediante un
detergente SDS y un choque alcalino con NaOH y se precipita el plásmido recombinante con
isopropanol, para luego digerirlo con enzimas de restricción BamHI y NdeI debido a que el vector
utilizado en la transformación tiene dos sitios de restricción para enzimas diferentes de manera que
cortando con estas dos enzimas se libera sólo el fragmento de interés; se procedió a cargar en un gel de
agarosa al 1% teñido con EtBr y se observó con respecto a un marcador de tamaño molecular del
bacteriófago lambda digerido con HindIII. En los resultados se muestran 3 carriles con diferentes pesos
moleculares, correspondientes a: el plásmido híbrido~6456 p.b., otro fragmento con peso molecular
que corresponde al plásmido digerido con las 2 enzimas de ~5370 p.b. y un fragmento de peso
molecular de ~1284 p.b. (inserto).
Palabras clave: Endonucleasas-enzimas de restricción provenientes de Eubacterias y Arqueas.
BamHI: enzima de restricción descubierta en Bacillus amyloliquefaciens. NdeI: enzima de restricción
aislada de Neisseria denitrificans. p.b.: pares de bases.
INTRODUCCIÓN
se pueden insertar u obtener utilizando enzimas
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN
de restricción (usualmente las de tipo II). Para
circular que se replican de manera autónoma en
asegurar que las bacterias transformadas poseen
procariontes. Debido a su capacidad de
el vector recombinante con la secuencia de
replicarse rápidamente, se utilizan como
interés se utiliza una técnica de monitoreo
vectores de clonación de genes de interés, el cual
genotípico: aislamiento de plásmido y
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