METHODEN: GENTRANSCRIPTIE REGULATIE
Elke cel van een organisme bezit dezelfde genetische informatie. Regulatie van genexpresssie
bepaalt welke RNAs en proteïnen gesynthetiseerd worden en hoeveel ervan.
→ basis voor cel differentiatie en respons op interne of externe signalen
Regulatie van genexpressie gebeurt op verschillende niveaus. Na transcriptie kan splicing gebeuren,
de stabiliteit van de RNA in cytoplasma is ook een belangrijke manier van regulatie. We gaan kijken
naar de transcriptie regulatie in eukaryote cellen. Heterochromatine, transcriptiefactoren,
promotor, initiatie, elongatie en terminatie. De enhancers gaan de transcriptie kunnen verhogen.
Nascent RNA analyse
Meet transcriptie activiteit via kwantificatie van gelabelde nascent RNA molceulen (=ontluikend RNA
of nieuw afgeschreven RNA). Bij de nascent RNA ga je direct de regulatie meten.
Run-on assays
Basis Run-on assay
Deze assay bestaat al heel lang. RNA polymerased is aan het elongeren en dan gaan de cellen
bevroren worden op ijs. Dan worden maar bepaalde RNAs afgeschreven. De activiteit van het
polymerace gaat gemeten worden op deze cellen en dus ook op welke genen. Vervolgens worden de
nuclei verwijdert. Men wilt de kernen labelen met radioactiviteit en dan terug het polymerase
toevoegen en vervolgens het radioactief materiaal.
Het polymerase kan enkel verder gaan met elongatie met wat al bezig was want
al de rest staat vast (doordat de cellen op ijs zitten). RNA gaat hybridiseren met
DNA pobes en dan kan men zien hoeveel van het RNA afgeschreven wordt en
van welke genen. Hier bestaan variaties op. (enkel specifiek)
GRO-Seq = Global Run-On sequencing
Genoom brede mapping van actieve polymerasen. Dit kan dus zowel specifiek als globaal. Men
maakt hier gebruik van gebromeerde UTPs deze kunnen dan in het DNA ingebouwd worden. Ee zijn
bepaalde antilichamen die kunnen binden aan die nascent RNA door de anti-BrdU domeinen op Ab.
Door deze binding van DNA met Ab → kunnen deze aan beads plakken en kan men contructie
maken van cDNA library en deep sequencing.
PRO-Seq = Precision nuclear Run-on sequencing
Genoom brede mapping van actieve polymerases met signle base resolutie.
Men gaat deze cellen terug op ijs zetten. Geen gebruik maken van radioactiviteit maar biotine.
Biotine NTP wordt ingecorporeerd. De elongatie kan niet meer verder gaan want er kan maar 1
nucleotide verder gebouwd worden na biotine gezien biotine te groot is. Het biotine zit dus in de
transcripten. De verschillende transcripten van verschillende genen met biotine erin. De lange
fragmenten kan men fragmenteren. Men zet een RNA adaptor aan het 3’ uiteinde (kleine oligo
sequentie is gekend). Pyrofosfatase gaat zorgen dat bepaalde RNAs geen cap meer hebben. Deze
gaan fosforyleren om te zorgen dat de oligo’s in gang kunnen schieten. Proliferatie.
De lange RNA fragmenten in stukken knippen – er gaat informatie verloren want je weet niet meer
waar het polymerase gestopt is. Oligo’s die geen cap hebben defosforyleren. Enkel de gecapte
kunnen ligeren aan een oligo.
1
, Andere nascent RNA analyse methoden
Je gaat zorgen dat enkel het chromatine geassocieerd RNA geisoleerd kan worden. alles dat in de cel
zit niet belangrijk. Men kan deze isoleren door verschillende wassingen met zoutbuffers. Men kan
next generation sequencing gebruiken om het RNA van de genen te bepalen.
Door deze isolatie krijg je ook splicing RNA die je ook gaat detecteren = achtergrond. Er zijn ook nog
long non-coding RNAs die ook op het chromatine zitten die je ook gaat detecteren. Al het RNA dat
geen cap heeft wordt afgebroken, enkel die met een cap zijn belangrijk.
Men kan antilichamen maken tegen het polymerase en kan hiermee het polymerase gaan
opzuiveren met beads en zo kan men weten welk RNA geassocieerd is met het polymerase.
Metabolische nascent RNA labeling = metabolische labeling. Men gaat de cellen op dat moment
incuberen met een UTP analoog met een zwaardere groep dat kan ingecorporeerd worden in het
RNA en zo ingebouwd kan worden. Deze zwaardere UTP kan dan verbonden worden aan biotine.
Men gaat deze UTP toevoegen aan groeiende cellen voor een bepaalde periode. Dan gaat men RNA
isoleren en fragmenteren van grote stukken. Men kan nu Tio uritine koppelen aan biotine.
Vervolgens wordt deze gekoppeld aan streptavidine zodat men RNA kan isoleren en sequencen.
Timelaps sequencing: cellen incorporeren met UTP en dan een bepaalde periode laten. En dan de
genen gaan vergelijken, kijken hoeveel expressie er is. Men gaat dan UTP → UCP. Deze moet je niet
aanrijken. RNA kan dan gewoon gesequenct worden; het bevat dus een mutatie. We kennen de
sequenties van de genen, al degene met een mutatie zijn dus tot expressie gekomen.
Chromatine-geassocieerde nascent RNA isolatie
Pol //-geassocieerde nascent RNA isolatie
Metabolische labeling
2
Elke cel van een organisme bezit dezelfde genetische informatie. Regulatie van genexpresssie
bepaalt welke RNAs en proteïnen gesynthetiseerd worden en hoeveel ervan.
→ basis voor cel differentiatie en respons op interne of externe signalen
Regulatie van genexpressie gebeurt op verschillende niveaus. Na transcriptie kan splicing gebeuren,
de stabiliteit van de RNA in cytoplasma is ook een belangrijke manier van regulatie. We gaan kijken
naar de transcriptie regulatie in eukaryote cellen. Heterochromatine, transcriptiefactoren,
promotor, initiatie, elongatie en terminatie. De enhancers gaan de transcriptie kunnen verhogen.
Nascent RNA analyse
Meet transcriptie activiteit via kwantificatie van gelabelde nascent RNA molceulen (=ontluikend RNA
of nieuw afgeschreven RNA). Bij de nascent RNA ga je direct de regulatie meten.
Run-on assays
Basis Run-on assay
Deze assay bestaat al heel lang. RNA polymerased is aan het elongeren en dan gaan de cellen
bevroren worden op ijs. Dan worden maar bepaalde RNAs afgeschreven. De activiteit van het
polymerace gaat gemeten worden op deze cellen en dus ook op welke genen. Vervolgens worden de
nuclei verwijdert. Men wilt de kernen labelen met radioactiviteit en dan terug het polymerase
toevoegen en vervolgens het radioactief materiaal.
Het polymerase kan enkel verder gaan met elongatie met wat al bezig was want
al de rest staat vast (doordat de cellen op ijs zitten). RNA gaat hybridiseren met
DNA pobes en dan kan men zien hoeveel van het RNA afgeschreven wordt en
van welke genen. Hier bestaan variaties op. (enkel specifiek)
GRO-Seq = Global Run-On sequencing
Genoom brede mapping van actieve polymerasen. Dit kan dus zowel specifiek als globaal. Men
maakt hier gebruik van gebromeerde UTPs deze kunnen dan in het DNA ingebouwd worden. Ee zijn
bepaalde antilichamen die kunnen binden aan die nascent RNA door de anti-BrdU domeinen op Ab.
Door deze binding van DNA met Ab → kunnen deze aan beads plakken en kan men contructie
maken van cDNA library en deep sequencing.
PRO-Seq = Precision nuclear Run-on sequencing
Genoom brede mapping van actieve polymerases met signle base resolutie.
Men gaat deze cellen terug op ijs zetten. Geen gebruik maken van radioactiviteit maar biotine.
Biotine NTP wordt ingecorporeerd. De elongatie kan niet meer verder gaan want er kan maar 1
nucleotide verder gebouwd worden na biotine gezien biotine te groot is. Het biotine zit dus in de
transcripten. De verschillende transcripten van verschillende genen met biotine erin. De lange
fragmenten kan men fragmenteren. Men zet een RNA adaptor aan het 3’ uiteinde (kleine oligo
sequentie is gekend). Pyrofosfatase gaat zorgen dat bepaalde RNAs geen cap meer hebben. Deze
gaan fosforyleren om te zorgen dat de oligo’s in gang kunnen schieten. Proliferatie.
De lange RNA fragmenten in stukken knippen – er gaat informatie verloren want je weet niet meer
waar het polymerase gestopt is. Oligo’s die geen cap hebben defosforyleren. Enkel de gecapte
kunnen ligeren aan een oligo.
1
, Andere nascent RNA analyse methoden
Je gaat zorgen dat enkel het chromatine geassocieerd RNA geisoleerd kan worden. alles dat in de cel
zit niet belangrijk. Men kan deze isoleren door verschillende wassingen met zoutbuffers. Men kan
next generation sequencing gebruiken om het RNA van de genen te bepalen.
Door deze isolatie krijg je ook splicing RNA die je ook gaat detecteren = achtergrond. Er zijn ook nog
long non-coding RNAs die ook op het chromatine zitten die je ook gaat detecteren. Al het RNA dat
geen cap heeft wordt afgebroken, enkel die met een cap zijn belangrijk.
Men kan antilichamen maken tegen het polymerase en kan hiermee het polymerase gaan
opzuiveren met beads en zo kan men weten welk RNA geassocieerd is met het polymerase.
Metabolische nascent RNA labeling = metabolische labeling. Men gaat de cellen op dat moment
incuberen met een UTP analoog met een zwaardere groep dat kan ingecorporeerd worden in het
RNA en zo ingebouwd kan worden. Deze zwaardere UTP kan dan verbonden worden aan biotine.
Men gaat deze UTP toevoegen aan groeiende cellen voor een bepaalde periode. Dan gaat men RNA
isoleren en fragmenteren van grote stukken. Men kan nu Tio uritine koppelen aan biotine.
Vervolgens wordt deze gekoppeld aan streptavidine zodat men RNA kan isoleren en sequencen.
Timelaps sequencing: cellen incorporeren met UTP en dan een bepaalde periode laten. En dan de
genen gaan vergelijken, kijken hoeveel expressie er is. Men gaat dan UTP → UCP. Deze moet je niet
aanrijken. RNA kan dan gewoon gesequenct worden; het bevat dus een mutatie. We kennen de
sequenties van de genen, al degene met een mutatie zijn dus tot expressie gekomen.
Chromatine-geassocieerde nascent RNA isolatie
Pol //-geassocieerde nascent RNA isolatie
Metabolische labeling
2
