Inhoudsopgave
Inleidende begrippen..................................................................................................................................... 3
Soorten scheidingstechnieken..............................................................................................................................3
Chromatografie....................................................................................................................................................3
Wat is chromatografie?...................................................................................................................................3
Indeling chromatografie naar aard van mobiele- en stationaire fase.............................................................5
Doelstelling van chromatografie.....................................................................................................................6
uitwisselingsprincipes.................................................................................................................................... 6
Adsorptiechromatografie.....................................................................................................................................6
Verdelingschromatografie/ partitiechromatografie/ partition chromatography...............................................7
Ionenuitwisselingschromatografie IEC.................................................................................................................9
Stationaire fase bij ionenuitwisselingschromatografie...................................................................................9
Verloop ionenuitwisselingschromatografie..................................................................................................10
Keuze van de ionenuitwisselaar....................................................................................................................11
Buffers............................................................................................................................................................12
Affiniteitschromatografie...................................................................................................................................12
Gelfiltratiechromatografie GFC/ steric-exclusion chromatography/ size-exclusion chromatography (SEC) /
gel-permeation chromatography (GPC).............................................................................................................14
Hydrofobe intractiechromatografie (HIC)..........................................................................................................16
Staalvoorbereiding....................................................................................................................................... 17
Staal voorbereiden voor extractie......................................................................................................................18
Extractie.............................................................................................................................................................18
Klassieke vloeistof-vloeistof extractie...........................................................................................................18
Vaste stof-vloeistof extractie.........................................................................................................................18
Vaste-fase extractie/ solid phase extraction (SPE)........................................................................................19
Derivatisatie.......................................................................................................................................................20
Alkylering.......................................................................................................................................................20
Silylering.........................................................................................................................................................21
Acylering........................................................................................................................................................21
Standaardisatie..................................................................................................................................................21
Externe standaard..........................................................................................................................................21
Interne standaard..........................................................................................................................................22
Staalvoorbereiding voor eiwitopzuivering.........................................................................................................22
Extractie van proteïnen uit weefsels en cellen..............................................................................................23
klaring van proteïnen.....................................................................................................................................23
Chromatografie............................................................................................................................................ 27
Papierchromatografie........................................................................................................................................27
Chromatografiepapier...................................................................................................................................27
Papierchromatografie uitvoeren...................................................................................................................27
Tweedimensionele papierchromatografie....................................................................................................29
Dunnelaagchromatografie DLC / thin layer chromatography TLC....................................................................29
Adsorbentia...................................................................................................................................................29
De keuze van het absorbens en het solventsysteem....................................................................................30
Voorbereiden van een DLC-plaat...................................................................................................................30
1
, Voorbereiden van de elutietank....................................................................................................................30
Het aanbrengen van het staal = product spotten..........................................................................................30
Ontwikkeling van de dunnelaagplaat............................................................................................................30
Zichtbaar maken van de vlekken...................................................................................................................31
Reproduceerbaarheid van de Rf-waarde......................................................................................................31
Tweedimensionele chromatografie...............................................................................................................31
Kwantitatieve aspecten van DLC...................................................................................................................31
Praktisch nut van DLC....................................................................................................................................32
Theoretische aspecten van verdelingschromatografie......................................................................................32
Counter current distribution (tegenstroomverdelingsproces) volgens Craig...............................................32
Van Deemter-vergelijking..............................................................................................................................33
Kolomchromatografie........................................................................................................................................36
Chromatogram...............................................................................................................................................36
Gaschromatografie........................................................................................................................................40
Vloeistofchromatografie................................................................................................................................48
Detectiemethoden....................................................................................................................................... 55
HPLC detectoren.................................................................................................................................................56
GC detectoren.....................................................................................................................................................56
Methode- validatie...................................................................................................................................... 56
Kalibratiecurve – lineariteit................................................................................................................................56
Detectielimiet (LOD) en kwantificatielimiet (LOQ).............................................................................................56
Precisie en accuraatheid....................................................................................................................................57
Selectiviteit.........................................................................................................................................................58
Stabiliteit............................................................................................................................................................58
Terugvinding.......................................................................................................................................................58
2
,Inleidende begrippen
Soorten scheidingstechnieken
Filtratie: verschil in deeltjesgrootte
Extractie: verschil in oplosbaarheid
Destillatie: verschil in kookpunt
Indampen: verschil in kookpunt
Centrifugeren/decanteren: verschil in massadichtheid
Elektroforese: verschil in lading
Chromatografie: verschil in oplosbaarheid, grootte, polariteit, adsorptie, vluchtigheid
Kwalitatieve bepaling: correcte identificatie
Kwantitatieve bepaling: concentratiebepaling
Chromatografie
Wat is chromatografie?
Chromatografie: een scheidingstechniek die gebruik maakt van 2 niet-mengbare fasen. De
ene, een mobiele fase, stroomt langs de andere, een stationaire fase.
Mobiele fase = bewegende, circulerende fase = MF: een gas of een vloeistof die zich over de
stationaire fase beweegt
Stationaire fase = stilstaande fase = SF: een vaste stof of een vloeistof die vastzit in een
kolom, op een plaat of op papier
Mengsel (staal) oplossen en op SF brengen
MF langs/doorheen SF laten stromen
Interactie tussen componenten van het staal en de SF en MF
Enkel component in MF migreert de component
-> componenten met verschillende wisselwerking met SF en MF zullen met verschillende
snelheid migreren
De gemiddelde snelheid waarmee een component uit het staal migreert doorheen de kolom
wordt dus bepaald door de tijd dat de component doorbrengt in de mobiele fase
kolomchromatografie
Elutie: de passage van de mobiele fase doorheen de kolom
Eluens, eluent: de mobiele fase in kolomchromatografie
Eluaat: wanneer de mobiele fase na de chromatografische scheiding de kolom verlaat
3
, Chromatogram: geeft het verband weer tussen het detectorsignaal en de tijd die verloopt
vanaf de start van de scheiding
Retentietijd tr: de tijd die verloopt tussen het begin van de scheiding (injectie van het staal)
en het verschijnen van het piekmaximum van een component
Dode tijd t0 of tm: de tijd die een onvertraagd component in mobiele fase nodig heeft om door
de kolom te stromen
Retentievolume Vr: de mobiele fase stroomt met een constante snelheid door de kolom
Vr = tr*u
De breedte van de piek gemeten aan de basis, baseline width, w, wordt bepaald door de
hellingen van de piek te extrapolleren tot de basislijn.
Plaats van piek -> aard van stof
Oppervlak piek -> hoeveelheid stof
Resolutie Rs tussen twee pieken bij een chromatografische techniek is de mate waarin
stoffen gescheiden worden gedurende de looptijd van het experiment
Dunnelaagchromatografie DLC
= een vorm van planaire chromatografie
De stationaire fase is als een dunne laag op een vlakke glas-aluminium- of kunststofplaat
aangebracht
De mobiele fase, het eluens, is meestal een organisch solvent of een mengsel van solventen.
De mobiele fase beweegt door de capillaire krachten over de stationaire fase.
4
Inleidende begrippen..................................................................................................................................... 3
Soorten scheidingstechnieken..............................................................................................................................3
Chromatografie....................................................................................................................................................3
Wat is chromatografie?...................................................................................................................................3
Indeling chromatografie naar aard van mobiele- en stationaire fase.............................................................5
Doelstelling van chromatografie.....................................................................................................................6
uitwisselingsprincipes.................................................................................................................................... 6
Adsorptiechromatografie.....................................................................................................................................6
Verdelingschromatografie/ partitiechromatografie/ partition chromatography...............................................7
Ionenuitwisselingschromatografie IEC.................................................................................................................9
Stationaire fase bij ionenuitwisselingschromatografie...................................................................................9
Verloop ionenuitwisselingschromatografie..................................................................................................10
Keuze van de ionenuitwisselaar....................................................................................................................11
Buffers............................................................................................................................................................12
Affiniteitschromatografie...................................................................................................................................12
Gelfiltratiechromatografie GFC/ steric-exclusion chromatography/ size-exclusion chromatography (SEC) /
gel-permeation chromatography (GPC).............................................................................................................14
Hydrofobe intractiechromatografie (HIC)..........................................................................................................16
Staalvoorbereiding....................................................................................................................................... 17
Staal voorbereiden voor extractie......................................................................................................................18
Extractie.............................................................................................................................................................18
Klassieke vloeistof-vloeistof extractie...........................................................................................................18
Vaste stof-vloeistof extractie.........................................................................................................................18
Vaste-fase extractie/ solid phase extraction (SPE)........................................................................................19
Derivatisatie.......................................................................................................................................................20
Alkylering.......................................................................................................................................................20
Silylering.........................................................................................................................................................21
Acylering........................................................................................................................................................21
Standaardisatie..................................................................................................................................................21
Externe standaard..........................................................................................................................................21
Interne standaard..........................................................................................................................................22
Staalvoorbereiding voor eiwitopzuivering.........................................................................................................22
Extractie van proteïnen uit weefsels en cellen..............................................................................................23
klaring van proteïnen.....................................................................................................................................23
Chromatografie............................................................................................................................................ 27
Papierchromatografie........................................................................................................................................27
Chromatografiepapier...................................................................................................................................27
Papierchromatografie uitvoeren...................................................................................................................27
Tweedimensionele papierchromatografie....................................................................................................29
Dunnelaagchromatografie DLC / thin layer chromatography TLC....................................................................29
Adsorbentia...................................................................................................................................................29
De keuze van het absorbens en het solventsysteem....................................................................................30
Voorbereiden van een DLC-plaat...................................................................................................................30
1
, Voorbereiden van de elutietank....................................................................................................................30
Het aanbrengen van het staal = product spotten..........................................................................................30
Ontwikkeling van de dunnelaagplaat............................................................................................................30
Zichtbaar maken van de vlekken...................................................................................................................31
Reproduceerbaarheid van de Rf-waarde......................................................................................................31
Tweedimensionele chromatografie...............................................................................................................31
Kwantitatieve aspecten van DLC...................................................................................................................31
Praktisch nut van DLC....................................................................................................................................32
Theoretische aspecten van verdelingschromatografie......................................................................................32
Counter current distribution (tegenstroomverdelingsproces) volgens Craig...............................................32
Van Deemter-vergelijking..............................................................................................................................33
Kolomchromatografie........................................................................................................................................36
Chromatogram...............................................................................................................................................36
Gaschromatografie........................................................................................................................................40
Vloeistofchromatografie................................................................................................................................48
Detectiemethoden....................................................................................................................................... 55
HPLC detectoren.................................................................................................................................................56
GC detectoren.....................................................................................................................................................56
Methode- validatie...................................................................................................................................... 56
Kalibratiecurve – lineariteit................................................................................................................................56
Detectielimiet (LOD) en kwantificatielimiet (LOQ).............................................................................................56
Precisie en accuraatheid....................................................................................................................................57
Selectiviteit.........................................................................................................................................................58
Stabiliteit............................................................................................................................................................58
Terugvinding.......................................................................................................................................................58
2
,Inleidende begrippen
Soorten scheidingstechnieken
Filtratie: verschil in deeltjesgrootte
Extractie: verschil in oplosbaarheid
Destillatie: verschil in kookpunt
Indampen: verschil in kookpunt
Centrifugeren/decanteren: verschil in massadichtheid
Elektroforese: verschil in lading
Chromatografie: verschil in oplosbaarheid, grootte, polariteit, adsorptie, vluchtigheid
Kwalitatieve bepaling: correcte identificatie
Kwantitatieve bepaling: concentratiebepaling
Chromatografie
Wat is chromatografie?
Chromatografie: een scheidingstechniek die gebruik maakt van 2 niet-mengbare fasen. De
ene, een mobiele fase, stroomt langs de andere, een stationaire fase.
Mobiele fase = bewegende, circulerende fase = MF: een gas of een vloeistof die zich over de
stationaire fase beweegt
Stationaire fase = stilstaande fase = SF: een vaste stof of een vloeistof die vastzit in een
kolom, op een plaat of op papier
Mengsel (staal) oplossen en op SF brengen
MF langs/doorheen SF laten stromen
Interactie tussen componenten van het staal en de SF en MF
Enkel component in MF migreert de component
-> componenten met verschillende wisselwerking met SF en MF zullen met verschillende
snelheid migreren
De gemiddelde snelheid waarmee een component uit het staal migreert doorheen de kolom
wordt dus bepaald door de tijd dat de component doorbrengt in de mobiele fase
kolomchromatografie
Elutie: de passage van de mobiele fase doorheen de kolom
Eluens, eluent: de mobiele fase in kolomchromatografie
Eluaat: wanneer de mobiele fase na de chromatografische scheiding de kolom verlaat
3
, Chromatogram: geeft het verband weer tussen het detectorsignaal en de tijd die verloopt
vanaf de start van de scheiding
Retentietijd tr: de tijd die verloopt tussen het begin van de scheiding (injectie van het staal)
en het verschijnen van het piekmaximum van een component
Dode tijd t0 of tm: de tijd die een onvertraagd component in mobiele fase nodig heeft om door
de kolom te stromen
Retentievolume Vr: de mobiele fase stroomt met een constante snelheid door de kolom
Vr = tr*u
De breedte van de piek gemeten aan de basis, baseline width, w, wordt bepaald door de
hellingen van de piek te extrapolleren tot de basislijn.
Plaats van piek -> aard van stof
Oppervlak piek -> hoeveelheid stof
Resolutie Rs tussen twee pieken bij een chromatografische techniek is de mate waarin
stoffen gescheiden worden gedurende de looptijd van het experiment
Dunnelaagchromatografie DLC
= een vorm van planaire chromatografie
De stationaire fase is als een dunne laag op een vlakke glas-aluminium- of kunststofplaat
aangebracht
De mobiele fase, het eluens, is meestal een organisch solvent of een mengsel van solventen.
De mobiele fase beweegt door de capillaire krachten over de stationaire fase.
4
