SAMENVATTING CYTOLOGIE
1
,Hoofdstuk 1: prepareren en observeren
van cellen en weefsels
DOEL
Cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
PROBLEEM
Biologische materiaal = te dik om licht door te laten
1.1 Gebruik van secties
= nodig om subcellulaire details waar te nemen
1. Fixeren
Weefselstuk weggenomen uit zijn normale situatie
o Afbraakenzymen actief
o Degradatie van het weefsel
Dit tegengaan door denaturatie van eiwitten
o Bevriezen
o Chemische fixatiemiddelen
Bevriezen
- Snel werken
- Bewaart epitopen beter voor imuunkleuringen
- Gebruikt in pathologische labo’s
Chemische fixatie
- Cross linken: met formaldehyde of gluteraldehyde
o Cel/weefselcomponenten blijven bewaard
- Neerslaan = percipiteren: met alcohol of aceton
o Structurele componenten worden bewaard
- Belangrijk = in vivo structuur bewaard blijft
- Veranderingen in weefsel = artefacten vb holtes
2
, 2. Inbedden
= gefixeerde middel moet met een substantie hard gemaakt worden
o Coupes te krijgen waar stralen door kunnen
o Niet als het al bevroren geweest is
- Inbedmiddel = hydrofoob
- Moet volledig binnendringen anders slecht snijdbaar
o Water eerst verwijderen met alcohol
o Clearing met tolueen = mengbaar met alcohol en inbedmiddel
LM paraffine Dikte 5-10 Stalen messen draagglaasjes
EM Hars en plastic 60-70 nm Diamanten messen Metalen roosters
3. Snijden
Met microtoom
PROBLEEM:
Biologisch materiaal = weinig contrast componenten
1.2 Gebruik van kleuring
= gebaseerd op verschillen in affiniteit van kleurstof voor weefselcomponenten
o Coupes worden eerst gedeparafineerd met tolueen alvorens kleuring
a. Routinekleuring
= haematoxyline -eosine = HE
= bij PH 6
- Haematoxyline = blauw, kationisch +
- Eosine = oranje, anionisch –
o Kern = blauw
o Cytoplasma = oranje
o Blauw korrelig in cytoplasma = RNA
3
, b. Kleurbaarheid organische stoffen
Proteïnen
= aminozuren
= zure (COO-) en basische (NH3+) gropen
= overmaat hangt af van IEP en PH
o Bij PH 6 vooral +
o EOSINE
Nucleïnezuren
= DNA en RNA
= in kern
o HAEMATOXYLINE
Koolhydraten
= vaak verbonden met andere moleculen
= lossen op in waterig fixatief => gaan verloren
o Stof toevoegen die koolhydraten neerslaat
o Kleurbaar met cationische kleurstoffen
o Kunnen kleuromslag veroorzaken
= metachromasie in kraakbeen en mastcellen
Lipiden
= lossen op in alcohol
o Lege vlekken op LM
= fixatie met OsO4 bij EM
o Vetzuren bewaard bij fixatie + visualiseerbaar
c. Specifieke kleurtechnieken
Indifferente kleurstoffen
= kleuren vetten aan
= oil red O
Immunohistochemische kleuring
= kleuren specifieke bestanddelen aan op basis van
antigen/antilichaam binding
= antilichaam wordt voorzien van kleurstof
=DAB
Enzymkleuring
= activiteit aantonen
= gebruik van enzym specifiek substraat
= reactie = waarneembare neerslag
= G6PD kleuring
4
1
,Hoofdstuk 1: prepareren en observeren
van cellen en weefsels
DOEL
Cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
PROBLEEM
Biologische materiaal = te dik om licht door te laten
1.1 Gebruik van secties
= nodig om subcellulaire details waar te nemen
1. Fixeren
Weefselstuk weggenomen uit zijn normale situatie
o Afbraakenzymen actief
o Degradatie van het weefsel
Dit tegengaan door denaturatie van eiwitten
o Bevriezen
o Chemische fixatiemiddelen
Bevriezen
- Snel werken
- Bewaart epitopen beter voor imuunkleuringen
- Gebruikt in pathologische labo’s
Chemische fixatie
- Cross linken: met formaldehyde of gluteraldehyde
o Cel/weefselcomponenten blijven bewaard
- Neerslaan = percipiteren: met alcohol of aceton
o Structurele componenten worden bewaard
- Belangrijk = in vivo structuur bewaard blijft
- Veranderingen in weefsel = artefacten vb holtes
2
, 2. Inbedden
= gefixeerde middel moet met een substantie hard gemaakt worden
o Coupes te krijgen waar stralen door kunnen
o Niet als het al bevroren geweest is
- Inbedmiddel = hydrofoob
- Moet volledig binnendringen anders slecht snijdbaar
o Water eerst verwijderen met alcohol
o Clearing met tolueen = mengbaar met alcohol en inbedmiddel
LM paraffine Dikte 5-10 Stalen messen draagglaasjes
EM Hars en plastic 60-70 nm Diamanten messen Metalen roosters
3. Snijden
Met microtoom
PROBLEEM:
Biologisch materiaal = weinig contrast componenten
1.2 Gebruik van kleuring
= gebaseerd op verschillen in affiniteit van kleurstof voor weefselcomponenten
o Coupes worden eerst gedeparafineerd met tolueen alvorens kleuring
a. Routinekleuring
= haematoxyline -eosine = HE
= bij PH 6
- Haematoxyline = blauw, kationisch +
- Eosine = oranje, anionisch –
o Kern = blauw
o Cytoplasma = oranje
o Blauw korrelig in cytoplasma = RNA
3
, b. Kleurbaarheid organische stoffen
Proteïnen
= aminozuren
= zure (COO-) en basische (NH3+) gropen
= overmaat hangt af van IEP en PH
o Bij PH 6 vooral +
o EOSINE
Nucleïnezuren
= DNA en RNA
= in kern
o HAEMATOXYLINE
Koolhydraten
= vaak verbonden met andere moleculen
= lossen op in waterig fixatief => gaan verloren
o Stof toevoegen die koolhydraten neerslaat
o Kleurbaar met cationische kleurstoffen
o Kunnen kleuromslag veroorzaken
= metachromasie in kraakbeen en mastcellen
Lipiden
= lossen op in alcohol
o Lege vlekken op LM
= fixatie met OsO4 bij EM
o Vetzuren bewaard bij fixatie + visualiseerbaar
c. Specifieke kleurtechnieken
Indifferente kleurstoffen
= kleuren vetten aan
= oil red O
Immunohistochemische kleuring
= kleuren specifieke bestanddelen aan op basis van
antigen/antilichaam binding
= antilichaam wordt voorzien van kleurstof
=DAB
Enzymkleuring
= activiteit aantonen
= gebruik van enzym specifiek substraat
= reactie = waarneembare neerslag
= G6PD kleuring
4
