Samenvatting les 3 flow cytometrie

Flow cytometrie : analytische
toepassingen
Toepassingen
 Immuunfenotypering
 Intracellulaire AG
 DNA-ploïdie en celcyclusanalyse
 Reticulocyten
 Absolute telling van relevante subsets (CD4+, CD3+, CD34+)
 Proliferatie
 Cel tracking
 Cytotoxicity assays
 Moleculaire nabijheids proximity metingen
 Apoptose
 Fagocyterend vermogen
 Oxidatieve burst
 IC cytokines
 Cytokinesecretie assays
 Tetrameer kleuringen
 Cel signalling: Ca2+, pH
 Reporter genen
 Flow microsfeer immunoassays
 Celsorting

Theorie in praktijk
Stamceltransplantatie: stamcel is voorlopercel van alle cellen in ons bloed
Bij bloedkanker gaat patiënt chemo ondergaan om de maligne bloedcellen te elimineren
Hiervoor wordt een beenmergpuntie gedaan -> meer stamcellen aanmaken in het beenmerg van de
patiënt
Bij oogsten van cellen bij de patiënt wil je zien hoeveel stamcellen aanwezig zijn -> CD34 en CD45
(alle witte bloedcellen aankleuren)




1

,  Intracellulaire AG (AG en fluorochromen die we hiervoor gebruiken moeten door
celmembraan kunnen gaan, membranen permeabiliseren)
 IC cytokines
 cytokinesecretie assays en flow microsfeer immonoassays

T lymfocytfunctie assay
 Fluorescentie microsfeer immunoassays
 IC cytokines
 Cytokinesecretie assays
Apoptose

T-cel herkent AG van DC met TcR
-> Tcel wordt geactiveerd
-> differentiatie in Th type 1 (reageert tegen virale
AG, tumoren, IFNgamma aanmaken) of Th type 2 cel
(tegen parasitaire infecties, allergische reacties ->
IL4)




Cytokines
Cytokines zijn kleine gesecreteerde proteïnen geproduceerd door lymfocyten
-> reguleren en moduleren immuniteit, inflammatie en hematopoïese
-> worden geproduceerd als respons op een immuunstimulus
-> binden aan specifieke membraanreceptoren

FMIA: fluorescence microsphere immuno assay/ CBA: cytometric bead array multiplex assay
Antigeenpresenterende cel -> activatie cytokines
-> supernatans met cytokines samenbrengen -> beads er bij voegen -> beads binden op cytokines
-> secundair AL toevoegen die ook de cytokines herkennen
-> hoe meer cytokines gebonden zijn hoe meer secundaire AL
-> hoe meer secundaire merker dat je detecteerd -> hoe meer cytokines


Welk cytokine wordt het meest geproduceerd?
IL10, hoe hoger op de y-as hoe meer gefluoresceerd

Wat is het nut van het 2de AL als er al een 1ste AL is dat
fluorescent is?
1ste: type cytokine bepalen
2de: bepalen hoeveel concentratie cytokine er is
gebonden per cytokine



Detectie van AG specifieke Tcellen
 Verschillende technieken: intracellulaire cytokinekleuring op gefixeerde cellen
o Meerdere cytokines op single-cell niveau


2