Samenvatting les 2 flow cytometrie.

Flow cytometrie : analytische
toepassingen, fluorescente sondes en
fluorescentiecompensatie
VRAGEN
Welke van onderstaande is de meest belangrijke voorwaarde/eigenschap voor/van flowcytometrie?
1. Mogelijk om mammalia cellen te meten
2. Maakt gebruik van laserlicht
3. Individuele cellen worden gemeten
4. Cellen kunnen gesorteerd worden
5. De resultaten kunnen geanalyseerd worden m.b.v.een pc
Antwoord: 3

Wat is de functie van de geleidingsvloeistof?
1. Verstrooiien van laserlicht
2. Celsuspensiestroom hydrodynamisch focuseren
3. Individuele cellen in suspensie houden
4. Afkoelen van suspensiestroom
5. Fluorescentie van cellen verbeteren
Antwoord: 2

Kan water een geleidingsvloeistof zijn?
1. Ja
2. Nee
Antwoord: 1, door verschil in concentratie tussen water en cellen kan osmose optreden -> niet bij
flowcytometrie -> water komt niet in contact met de cellen/celsuspensiestroom

Welke celeigenschap beïnvloedt voorwaartse lichtverstrooiing het meest?
1. Vorm
2. Verhouding kern/cytoplasma
3. Grootte
4. Aantal mitochondria
5. Optische heterogeniteit
Antwoord: 3

Welke eigenschap beïnvloedt zijwaartse lichtverstrooiing het meest?
1. Vorm
2. Verhouding kern/cytoplasma
3. Grootte
4. Aantal mitochondria
5. Optische heterogeniteit
Antwoord: 1,2,3,4 -> worden samengevat door 5, dus 5 is het antwoord

Een fluorochroom dat geëxiteerd wordt door blauw licht van 488nm zal…
1. Blauw fluoresceren
2. Groen fluoresceren
3. Fluoresceren met een golflengte groter dan 480nm
4. Fluoresceren met een golflengte kleiner dan 488nm


1

, Antwoord: 3 (groen zou ook kunnen maar je bent niet zeker kan ook oranje licht zijn), er wordt
minder E gebruikt om fluorochroom aan te stralen

Leerdoelen les 2
 Beschrijf doel van cel- of partikelsortering
 Beschrijf verschillende stappen van het sorteerproces
 Beschrijf het gebruik van excitatie- en emissiespectra
 Verklaar stokes shift
 Verklaar wat compensatie is en waarom het noodzakelijk is in multiparameter analyses
 Verklaar immuunfenotypering
 Begrijp welke fluorochromen gebruikt kunnen worden in een flowcytometer (afhankelijk van
beschikbare lasers en filters/detectoren

1.2. flow cytometrisch sorteringsprincipe
Sorter: Vloeistofstraal wordt in druppels opgebroken

 Analytisch instrument: analytische cel sorter
o Stream in quartz
o Laser ondervragingspunt bevindt zich in een
kwarts doorstroomcurve
 Cell sorter
o Stream in air / jet
o Laser ondervragingspunt bevindt zich in de vrije
vloeistofstraal




Sorteerprincipe is gebasseerd op techniek voor inktjet afdrukken:
Gebaseerd op inkt stralen = jets: worden hoog frequent opgebroken in druppels die dan
elektrostatisch worden afgebogen naar het papier
-> toekomst: sorteren van cellen voor de generatie van 3D weefsels en/of organen

Vloeistofstraal ontstaat uit vloeistofstroom
Druppelvorming door:
 Verstoring door instabiliteiten t.g.v. gravitatie, adhesie, oppervlaktespanningskrachten
 Rayleigh theorie: pertubatie met λ = 4,5 x de diameter van uitgangsopening
heeft max. groeisnelheid
 Pieco-elekrische element: trilling op vloeistofelement -> punt waarop eerste punt gevormd
wordt wordt vastgelegd in de flow cytometer

Pertubatie = doorgang maken voor

Opleggen van natuurlijke opbreek-frequentie m.b.v. ultrasone transducer
-> voor een d = 50 µm is dat bij λ = 225 µm (50 * 4,5)
-> frequentie = v/ λ waar vjet = 10 m/s -> frequentie = 44.4 kHz m.a.w. ~ 44000 druppels/s

Afbuigen door ladingspuls op te leggen en na afbuigingswachttijd (tijd tussen detectie van de cel en
haar verschijnen in afbrekende druppel)
-> tijdsduur ladingspuls = 1/frequentie = 23 µs
Afbuiging door ladingspuls op te leggen en straal doorheen hoogspanningsveld te sturen

2