Algemene informatie ............................................................................................ 3
1. Praktische afspraken: ........................................................................................ 3
1.1 De evaluatie:........................................................................................................... 3
1.1.1 De eindcompetenties: ............................................................................................................. 3
1.1.2 De evaluatiecriteria: ................................................................................................................ 3
1.1.3 Het verslag: .............................................................................................................................. 5
1.1.4 Vaardighedentoets: ................................................................................................................. 6
1.2 Afwezigheden ......................................................................................................... 6
2.Veiligheid .................................................................................................................. 6
2.1 Algemeen .................................................................................................................................... 6
2.2 Telefoonnummers en nuttige adressen ..................................................................................... 7
3. Het gebruik van semiautomatische pipetten .............................................................. 7
3.1 Gebruik ....................................................................................................................................... 7
3.2 Reverse pipetteren ..................................................................................................................... 8
3.3 Enkele tips: ................................................................................................................................. 9
4. Spectrofotometrie .................................................................................................... 9
4.1 Wet van lambert-Beer en principes van lichtabsorptie ........................................................... 10
4.2 IJklijnmethode .......................................................................................................................... 11
2. Introductie tot Labster ..................................................................................12
Experiment 1: Bepaling van succinaat dehydrogenase ..........................................13
1. Inleiding ................................................................................................................. 13
2.Oplossingen ............................................................................................................. 13
3. Experimenten ......................................................................................................... 14
3.1. Weefselfraktionatie ................................................................................................................. 14
3.1.1. Het maken van een leverhomogenaat. ............................................................................ 14
3.1.2. Differentiele centrifugatie ................................................................................................ 14
3.2 Bepaling van de intracellulaire activiteit van een enzyme: SDH-assay ..................................... 15
3.2.1 Opstellen van een ijklijn van TTC ...................................................................................... 15
3.2.2 Bepaling van de SDH activiteit in subcellulaire fracties ..................................................... 15
3.2.3. Bepaling van het drooggewicht ........................................................................................ 15
3.2.4 Bepaling van de uiteindelijke SDH activiteit ...................................................................... 16
Experiment 2: Afzonderen van het LDH-5 iso-enzym uit leverweefsel ....................17
1. Inleiding ................................................................................................................. 17
1.1 Lactaat dehydrogenase ............................................................................................................ 17
1.2 Doel van het experiment .......................................................................................................... 18
2. Oplossingen ............................................................................................................ 22
3. Ammoniumsulfaat precipitatie van de cytosolfractie ............................................... 23
4. Dialyse.................................................................................................................... 24
5. Testen van de eiwit en enzym concentratie ............................................................. 24
5.1 LDH-enzym assay ...................................................................................................................... 24
5.1.1 Werking van de spectrofotometer .................................................................................... 24
5.1.2 LADH-enzym assay ............................................................................................................. 25
5.2 Eiwittest: Methode van Bradford ............................................................................................. 26
6. Ionenuitwisselingschromatografie ........................................................................... 27
Geïntegreerd practicum Biochemie 1
, 7. Analyse van de zuiverheid ....................................................................................... 27
7.1 LDH iso-enzyme scheiding ....................................................................................................... 27
7.2 SDS-PAGE ................................................................................................................................. 29
7.2.1 Inleiding ............................................................................................................................. 29
7.2.2 Praktisch ............................................................................................................................ 30
7.3 Western blotting met anti-LDH antilichaam ............................................................................. 31
7.3.1 Inleiding ............................................................................................................................. 31
7.3.2 Methode: ........................................................................................................................... 31
7.3.3 Immunodetectie ................................................................................................................ 32
7.3.4 Detectie met ECL ............................................................................................................... 33
Experiment 3: Electroforetische scheidingen van serum op SDS-PAGE ..................34
Experiment 4: Fluorimetrische bepaling van kininesulfaat. ...................................35
1. Principe .................................................................................................................. 35
2. Oplossingen. ........................................................................................................... 36
3. Uitvoering............................................................................................................... 36
3.1. Registreren van een dovingscurve van kinine sulfaat ............................................................. 36
3.2. Opstellen van een kininesulfaat calibratiecurve in af- en aanwezigheid van jodide ............... 36
3.3. Multipele standaard-additiemethode. .................................................................................... 37
Experiment 5: Bepalen van de Km en Vm van lactaat dehydrogenase via een
kinetische methode ..............................................................................................38
1. Principe .................................................................................................................. 38
2. Opdracht Labster .................................................................................................... 39
3. Oplossingen ............................................................................................................ 39
4. Uitvoering............................................................................................................... 39
4.1. Bereiding van de verdunningsreeks ........................................................................................ 39
4.2. Standaarduitvoering van de kinetische enzymbepaling .......................................................... 40
4.3. Bepalen van het pH-optimum van Lactaat dehydrogenase .................................................... 40
4.4. Enzymactiviteit in functie van substraatconcentratie ............................................................. 40
Geïntegreerd practicum Biochemie 2
,Algemene informatie
Het geïntegreerd practicum Biochemie bestaat uit 7 practicumdagen. Tijdens deze dagen
worden er verschillende experimenten voorzien (zie blackboard voor planning). Wegens de
COVID maatregelen zullen er naast de live practica ook online experimenten voorzien
worden via Labster.
Tijdens de verschillende practica zullen een aantal essentiële labovaardigheden worden
verworven. Aan de hand van protocols leer je proeven correct uit te voeren. Ten slotte ga je
de bekomen resultaten verwerken, interpreteren en een wetenschappelijk verslag schrijven.
1. Praktische afspraken:
Breng steeds een labojas, rekenmachine, hangslot voor locker en een fijne
waterbestendige stift mee.
Bij afwezigheid zo snel mogelijk de practicumbegeleiding contacteren!
1.1 De evaluatie:
De evaluatie bestaat uit vier luiken: permanente evaluatie (10%), Vaardigheidstoets (40%),
Schriftelijke test (25%) , Verslag (25%) met peer assessment (-5%). Indien er op 1 van de
onderdelen minder dan 8/20 behaald wordt, worden de deelscores niet samengeteld en zal
de eindscore deze zijn van het laagst gescoorde onderdeel.
1.1.1 De eindcompetenties:
1. De student kan de basis moleculaire en biochemische technieken onder begeleiding op
correcte manier uitvoeren en de resultaten analyseren. De student heeft inzicht in de
achterliggende basisprincipes en kan deze toepassen op vergelijkbare situaties.
2. De student kan veilig en vakkundig gebruik maken van producten, technieken en basis
labotoestellen die aan bod komen tijdens het practicum.
3. De student kan een eenvoudig biochemisch experiment onder begeleiding plannen en
inschatten qua tijdsbesteding.
4. De student kan de bekomen resultaten schriftelijk analyseren, interpreteren, schematisch
voorstellen en toepassen.
5. De student kan in groep samenwerken en over de bekomen resultaten communiceren op
een wetenschappelijke manier, zowel mondeling als schriftelijk.
1.1.2 De evaluatiecriteria:
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld tijdens de permanente evaluatie (10%)
welke wordt beoordeeld a.d.h.v. een criterialijst (zie BB):
• Je toont dat je opgegeven experimenten kan voorbereiden en onder begeleiding kan
uitvoeren.
Geïntegreerd practicum Biochemie 3
, • Je toont dat je het labomateriaal correct kan gebruiken.
• Je toont dat je in groep kan samenwerken en op wetenschappelijke manier kan
communiceren met groepsgenoten en met de begeleiding.
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld tijdens de vaardigheidstoets (40%) welke
bestaat uit het reproduceren van een (deel van) experiment binnen een beperkte tijd.
• Je toont dat je een opgegeven experiment vlot kan uitvoeren en dat je een experiment
kan plannen binnen een beperkte tijd.
• Je toont dat je het labomateriaal veilig, nauwkeurig en correct kan gebruiken.
• Je toont dat je a.d.h.v. een protocol een eerder uitgevoerd experiment kan
reproduceren.
• Je toont dat je de geleerde veiligheidsvoorschriften kent en respecteert.
Voor de permanente evaluatie en de vaardigheidstoets samen (50% van het eindtotaal)
dient er minimum 10/20 behaald te worden om een credit te verwerven, omdat de student
anders de eindcompetenties 1 tem 5 niet bereikt heeft op het verwachte niveau (=
theoretische kennis en inzicht gebruiken in een praktische uitvoering).
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld tijdens de schriftelijke toets (25%) welke
bestaat uit 6 open vragen waarbij er gepeild wordt naar de kennis en inzicht in de
achterliggende principes van de experimenten en de hiermee gepaard gaande nodige
berekeningen.
• Je toont dat je de principes van concentratieberekening, berekenen van
verdunningsreeksen vraagstukken i.v.m. optische technieken en elektrochemie kent
en kan toepassen.
• Je toont dat je de inzichten in de achtergrond van de uitgevoerde experimenten
beheerst en dat je deze kan toepassen op eenvoudige experimentele casussen.
Wanneer een student geen 40% haalt op dit onderdeel kan geen credit worden verworven
omdat de student dan de essentiële eindcompetentie 1 niet heeft bereikt binnen het
verwachte niveau (= theoretische kennis en inzicht, toepassen op vergelijkbare situaties).
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld in het verslag (25%) met peer assessment
(-5%) welk een wetenschappelijke rapportering is van de uitgevoerde experimenten. Het
verslag wordt per groep gemaakt en er wordt 1 gezamenlijk punt toegekend aan beide
studenten.
Geïntegreerd practicum Biochemie 4
1. Praktische afspraken: ........................................................................................ 3
1.1 De evaluatie:........................................................................................................... 3
1.1.1 De eindcompetenties: ............................................................................................................. 3
1.1.2 De evaluatiecriteria: ................................................................................................................ 3
1.1.3 Het verslag: .............................................................................................................................. 5
1.1.4 Vaardighedentoets: ................................................................................................................. 6
1.2 Afwezigheden ......................................................................................................... 6
2.Veiligheid .................................................................................................................. 6
2.1 Algemeen .................................................................................................................................... 6
2.2 Telefoonnummers en nuttige adressen ..................................................................................... 7
3. Het gebruik van semiautomatische pipetten .............................................................. 7
3.1 Gebruik ....................................................................................................................................... 7
3.2 Reverse pipetteren ..................................................................................................................... 8
3.3 Enkele tips: ................................................................................................................................. 9
4. Spectrofotometrie .................................................................................................... 9
4.1 Wet van lambert-Beer en principes van lichtabsorptie ........................................................... 10
4.2 IJklijnmethode .......................................................................................................................... 11
2. Introductie tot Labster ..................................................................................12
Experiment 1: Bepaling van succinaat dehydrogenase ..........................................13
1. Inleiding ................................................................................................................. 13
2.Oplossingen ............................................................................................................. 13
3. Experimenten ......................................................................................................... 14
3.1. Weefselfraktionatie ................................................................................................................. 14
3.1.1. Het maken van een leverhomogenaat. ............................................................................ 14
3.1.2. Differentiele centrifugatie ................................................................................................ 14
3.2 Bepaling van de intracellulaire activiteit van een enzyme: SDH-assay ..................................... 15
3.2.1 Opstellen van een ijklijn van TTC ...................................................................................... 15
3.2.2 Bepaling van de SDH activiteit in subcellulaire fracties ..................................................... 15
3.2.3. Bepaling van het drooggewicht ........................................................................................ 15
3.2.4 Bepaling van de uiteindelijke SDH activiteit ...................................................................... 16
Experiment 2: Afzonderen van het LDH-5 iso-enzym uit leverweefsel ....................17
1. Inleiding ................................................................................................................. 17
1.1 Lactaat dehydrogenase ............................................................................................................ 17
1.2 Doel van het experiment .......................................................................................................... 18
2. Oplossingen ............................................................................................................ 22
3. Ammoniumsulfaat precipitatie van de cytosolfractie ............................................... 23
4. Dialyse.................................................................................................................... 24
5. Testen van de eiwit en enzym concentratie ............................................................. 24
5.1 LDH-enzym assay ...................................................................................................................... 24
5.1.1 Werking van de spectrofotometer .................................................................................... 24
5.1.2 LADH-enzym assay ............................................................................................................. 25
5.2 Eiwittest: Methode van Bradford ............................................................................................. 26
6. Ionenuitwisselingschromatografie ........................................................................... 27
Geïntegreerd practicum Biochemie 1
, 7. Analyse van de zuiverheid ....................................................................................... 27
7.1 LDH iso-enzyme scheiding ....................................................................................................... 27
7.2 SDS-PAGE ................................................................................................................................. 29
7.2.1 Inleiding ............................................................................................................................. 29
7.2.2 Praktisch ............................................................................................................................ 30
7.3 Western blotting met anti-LDH antilichaam ............................................................................. 31
7.3.1 Inleiding ............................................................................................................................. 31
7.3.2 Methode: ........................................................................................................................... 31
7.3.3 Immunodetectie ................................................................................................................ 32
7.3.4 Detectie met ECL ............................................................................................................... 33
Experiment 3: Electroforetische scheidingen van serum op SDS-PAGE ..................34
Experiment 4: Fluorimetrische bepaling van kininesulfaat. ...................................35
1. Principe .................................................................................................................. 35
2. Oplossingen. ........................................................................................................... 36
3. Uitvoering............................................................................................................... 36
3.1. Registreren van een dovingscurve van kinine sulfaat ............................................................. 36
3.2. Opstellen van een kininesulfaat calibratiecurve in af- en aanwezigheid van jodide ............... 36
3.3. Multipele standaard-additiemethode. .................................................................................... 37
Experiment 5: Bepalen van de Km en Vm van lactaat dehydrogenase via een
kinetische methode ..............................................................................................38
1. Principe .................................................................................................................. 38
2. Opdracht Labster .................................................................................................... 39
3. Oplossingen ............................................................................................................ 39
4. Uitvoering............................................................................................................... 39
4.1. Bereiding van de verdunningsreeks ........................................................................................ 39
4.2. Standaarduitvoering van de kinetische enzymbepaling .......................................................... 40
4.3. Bepalen van het pH-optimum van Lactaat dehydrogenase .................................................... 40
4.4. Enzymactiviteit in functie van substraatconcentratie ............................................................. 40
Geïntegreerd practicum Biochemie 2
,Algemene informatie
Het geïntegreerd practicum Biochemie bestaat uit 7 practicumdagen. Tijdens deze dagen
worden er verschillende experimenten voorzien (zie blackboard voor planning). Wegens de
COVID maatregelen zullen er naast de live practica ook online experimenten voorzien
worden via Labster.
Tijdens de verschillende practica zullen een aantal essentiële labovaardigheden worden
verworven. Aan de hand van protocols leer je proeven correct uit te voeren. Ten slotte ga je
de bekomen resultaten verwerken, interpreteren en een wetenschappelijk verslag schrijven.
1. Praktische afspraken:
Breng steeds een labojas, rekenmachine, hangslot voor locker en een fijne
waterbestendige stift mee.
Bij afwezigheid zo snel mogelijk de practicumbegeleiding contacteren!
1.1 De evaluatie:
De evaluatie bestaat uit vier luiken: permanente evaluatie (10%), Vaardigheidstoets (40%),
Schriftelijke test (25%) , Verslag (25%) met peer assessment (-5%). Indien er op 1 van de
onderdelen minder dan 8/20 behaald wordt, worden de deelscores niet samengeteld en zal
de eindscore deze zijn van het laagst gescoorde onderdeel.
1.1.1 De eindcompetenties:
1. De student kan de basis moleculaire en biochemische technieken onder begeleiding op
correcte manier uitvoeren en de resultaten analyseren. De student heeft inzicht in de
achterliggende basisprincipes en kan deze toepassen op vergelijkbare situaties.
2. De student kan veilig en vakkundig gebruik maken van producten, technieken en basis
labotoestellen die aan bod komen tijdens het practicum.
3. De student kan een eenvoudig biochemisch experiment onder begeleiding plannen en
inschatten qua tijdsbesteding.
4. De student kan de bekomen resultaten schriftelijk analyseren, interpreteren, schematisch
voorstellen en toepassen.
5. De student kan in groep samenwerken en over de bekomen resultaten communiceren op
een wetenschappelijke manier, zowel mondeling als schriftelijk.
1.1.2 De evaluatiecriteria:
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld tijdens de permanente evaluatie (10%)
welke wordt beoordeeld a.d.h.v. een criterialijst (zie BB):
• Je toont dat je opgegeven experimenten kan voorbereiden en onder begeleiding kan
uitvoeren.
Geïntegreerd practicum Biochemie 3
, • Je toont dat je het labomateriaal correct kan gebruiken.
• Je toont dat je in groep kan samenwerken en op wetenschappelijke manier kan
communiceren met groepsgenoten en met de begeleiding.
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld tijdens de vaardigheidstoets (40%) welke
bestaat uit het reproduceren van een (deel van) experiment binnen een beperkte tijd.
• Je toont dat je een opgegeven experiment vlot kan uitvoeren en dat je een experiment
kan plannen binnen een beperkte tijd.
• Je toont dat je het labomateriaal veilig, nauwkeurig en correct kan gebruiken.
• Je toont dat je a.d.h.v. een protocol een eerder uitgevoerd experiment kan
reproduceren.
• Je toont dat je de geleerde veiligheidsvoorschriften kent en respecteert.
Voor de permanente evaluatie en de vaardigheidstoets samen (50% van het eindtotaal)
dient er minimum 10/20 behaald te worden om een credit te verwerven, omdat de student
anders de eindcompetenties 1 tem 5 niet bereikt heeft op het verwachte niveau (=
theoretische kennis en inzicht gebruiken in een praktische uitvoering).
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld tijdens de schriftelijke toets (25%) welke
bestaat uit 6 open vragen waarbij er gepeild wordt naar de kennis en inzicht in de
achterliggende principes van de experimenten en de hiermee gepaard gaande nodige
berekeningen.
• Je toont dat je de principes van concentratieberekening, berekenen van
verdunningsreeksen vraagstukken i.v.m. optische technieken en elektrochemie kent
en kan toepassen.
• Je toont dat je de inzichten in de achtergrond van de uitgevoerde experimenten
beheerst en dat je deze kan toepassen op eenvoudige experimentele casussen.
Wanneer een student geen 40% haalt op dit onderdeel kan geen credit worden verworven
omdat de student dan de essentiële eindcompetentie 1 niet heeft bereikt binnen het
verwachte niveau (= theoretische kennis en inzicht, toepassen op vergelijkbare situaties).
De volgende evaluatiecriteria worden beoordeeld in het verslag (25%) met peer assessment
(-5%) welk een wetenschappelijke rapportering is van de uitgevoerde experimenten. Het
verslag wordt per groep gemaakt en er wordt 1 gezamenlijk punt toegekend aan beide
studenten.
Geïntegreerd practicum Biochemie 4
