Module 1
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Lichtmicroscopie TEM
Bron: zichtbaar licht: object w bekeken Bron: bundel elektronen om een opp./inhoud van
objecten af te beelden: schiet elektronen door
preparaat en worden opgevangen dmv een
gevoelige plaat.
Lagere resolutie: fotonen hebben een lage golfsnelheid Hogere resolutie: versnelde elektronen hebben
dan elektronen veel kleinere golflengte dan fotonen
cellulaire structuren bestuderen van weefsels. Voor intracellulaire structuren bestuderen van weefsels.
visualisatie van de vinger, haar, bloed, bloedcel, Voor visualisatie van bloedcellen, bacteriën,
bacteriën virussen, DNA, glucose, atomen
Weefselpreparatie:Bewaring: Fixatie: fragmenten max. 1-2mm groot, gebeurt in
Fixatie: gekoelde glutaaraldehyde, 2de fixatie in
● weefsel ondergedompeld in fixatievloeistof osmiumtetroxide (vetten bewaren+ voegt extra
(formol, waterige oplossing van formaldehyde) gewicht toe aan bepaalde locaties v/h weefsel→
→ meeste enzymen verliezen enzymatische beter zichtbaar)
werking
→ materiaal kan niet direct gesneden worden Staalpreparatie: dunne coupes maken (1
(zacht). micrometer), fixeerde weefsels worden ingebed in
● Snijden:ingebed worden in paraffine, eerst hard materiaal (epoxyhars), coupes worden
ontdaan worden van alle water d.m.v. weefsel gesneden met een diamantmes of glasmes.
in oplopende alcoholoplossingen te plaatsen.
W dan uitgespoeld met tolueen of xyleen. Stalen kleuren: Door de 2de fixatie (met
Invriezen: osmiumtetroxide) kleuren de weefsels ook,
● moet zeer snel, enkel bij kleine weefselstukken. plaatsen waar veel osmium is gaan elektronen niet
● Ingevroren in een OCT oplossing (oplossing van makkelijk doorheen (donkere schaduw)
glycol en bepaalde soorten hars) adhv Om Specifieke moleculen aan te tonen →
onderkoeld isopentaan. immunolabeling met antistoffen met goud-labels
● Daarna w ze gesneden in vriescoupes met (weefsel wordt gebkleurs met een antistof waar
gekoeld microtoom. een goudpartikel aan hangt.
→ structuur van de eiwitten blijft ongewijzigd,
enzymatische werking w vertraagd/ stillgelegd, bij
ontdooing (37°) krijgen ze hun volledige fuctie terug
2. Het verwaardigen van weefselsneden
3. het kleuren v/d weefsels
, Resolutie: de
mogelijkheid v/e optisch
systeem om 2
nabijgelegen objecten
nog afzonderlijk weer te
geven.
2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Lichtmicroscoop:
● Verteringsprocessen worden afgeremd waardoor ook groei van micro-organismen stopt.
● Weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator).
● Hierdoor worden covalente bindingen gevormd met N-terminale groepen van eiwitten,
volgens “crosslinking”.
→ Eiwitten worden zo aan cytoskelet en hun interagerende eiwitten vastgehecht.
● Meeste enzymen verliezen hun enzymatische werking.
● Duur varieert van 2h tot 24h, afhankelijk van grootte materiaal, en gebruikte methode van
fixatie en fixator. Hoeveelheid fixator minimaal 5x het volume van weefsel.
● Formol= waterige oplossing op basis van formaldehyde, meest gebruikte fixator.
Elektronenmicroscoop:
● Goede en snelle fixatie cruciaal.
● Kwaliteit afhankelijk van grootte weefselfragment gebruikte fixator.
● Fragmenten maximum 1-2 mm groot.
● In gekoelde (4°C) glutaaraldehyde.
● Gevolgd door 2e fixatie in osmiumtetroxide (OsO4) om vetten te bewaren (o.a. door oxidatie
van onverzadigde vetten).
→ deze voegt extra ‘gewicht’ toe aan welbepaalde locaties weefsel zodat deze beter zichtbaar
is in een elektronenmicroscoop.
→ kleurt het weefsel
,3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en immunofluorescentie.
4. Bespreek directe, indirecte en geamplificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Directe immunohistochemie:
● het primaire antistof wordt rechtstreeks gekoppeld aan het detectie-enzym.
● Techniek is snel en eenvoudig maar geeft weinig signaalversterking en lage
hoeveelheden AG worden veel moeilijker gedetecteerd.
→ om immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid- en nierbiopten
→ beste resultaat in vriescoupes
→ met label fluoresceïne
Indirecte immunohistochemie:
● secundaire antistof gericht tegen het FC-fragment van de primaire antistof, en dat gekoppeld
is aan het detectie-enzym.
● Voordeel is dat niet steeds de primaire antistof wordt gekoppeld. Dezelfde secundaire antistof
kan gebruikt worden tegen alle muis antilichamen.
● Ten tweede wordt er ook signaalversterking bekomen.
Geamplificeerde immunohistochemie:
● signaalversterking bekomen door gebruik van biotine streptavidine systeem.
- 2 stoffen die zeer sterk met elkaar interageren en grote complexen vormen.
- Meestal wordt het antistof met biotine gebonden en zal het detectie enzym wat ook
aan biotine is gebonden gecomplexeerd worden met streptavidine om zo een veel
hogere enzymactiviteit te bekomen, en dus ook een sterker signaal.
Immunofluorescentie:
● het primaire of secundaire AS wordt gekoppeld aan een fluorofoor die wanneer hij wordt
beschenen met licht van de juiste golflengte, fluorescent licht zal uitstralen
→ Er kunnen gemakkelijk verschillende AG op eenzelfde slide worden gevisualiseerd door
verschillende fluoroforen die verschillende kleuren licht uitzenden te gebruiken.
Deze methoden bestaan omdat elke methode verschilt in sensitiviteit, specificiteit, affiniteit van de
antistof en beschikbaarheid van de epitopen.
, 5. Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens
operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
a. Bewaring en fixering van weefsel
Fixatie: weefsel w ondergedompeld in fixatievloeistof (formol, waterige oplossing van
formaldehyde)
→ meeste enzymen verliezen enzymatische werking
→ materiaal kan niet direct gesneden worden (zacht). Om te snijden moet het ingebed worden in
paraffine, eerst ontdaan worden van alle water dmv weefsel in oplopende alcoholoplossingen te
plaatsen. W dan uitgespoeld met tolueen of xyleen.
Invriezen: moet zeer snel, enkel bij kleine weefselstukken. Ingevroren in een OCT oplossing
(oplossing van glycol en bepaalde soorten hars) adhv onderkoeld isopentaan. Daarna w ze gesneden
in vriescoupes met gekoeld microtoom.
→ structuur van de eiwitten blijft ongewijzigd, enzymatische werking w vertraagd/ stillgelegd,
bij ontdooing (37°) krijgen ze hun volledige fuctie terug
b. Vervaardigen van weefselsneden (coupes)
a) Versnijden en insluiten
b) Impregneren met paraffine
c) Gieten van de paraffineblok
d) Snijden van 2-5 micrometer coupes draagglaasjes monteren
c. Kleuren van de weefselsnedes
d. Afdekken
6. Antilichamen spelen een cruciale rol bij immunohistochemie: Bespreek de structuur van een
antilichaam en bespreek de gelijkenissen en verschillen tussen monoklonale & polyklonale
antistoffen.
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel
voorbewerkt worden voor deze methoden en waarom?
Lichtmicroscopie TEM
Bron: zichtbaar licht: object w bekeken Bron: bundel elektronen om een opp./inhoud van
objecten af te beelden: schiet elektronen door
preparaat en worden opgevangen dmv een
gevoelige plaat.
Lagere resolutie: fotonen hebben een lage golfsnelheid Hogere resolutie: versnelde elektronen hebben
dan elektronen veel kleinere golflengte dan fotonen
cellulaire structuren bestuderen van weefsels. Voor intracellulaire structuren bestuderen van weefsels.
visualisatie van de vinger, haar, bloed, bloedcel, Voor visualisatie van bloedcellen, bacteriën,
bacteriën virussen, DNA, glucose, atomen
Weefselpreparatie:Bewaring: Fixatie: fragmenten max. 1-2mm groot, gebeurt in
Fixatie: gekoelde glutaaraldehyde, 2de fixatie in
● weefsel ondergedompeld in fixatievloeistof osmiumtetroxide (vetten bewaren+ voegt extra
(formol, waterige oplossing van formaldehyde) gewicht toe aan bepaalde locaties v/h weefsel→
→ meeste enzymen verliezen enzymatische beter zichtbaar)
werking
→ materiaal kan niet direct gesneden worden Staalpreparatie: dunne coupes maken (1
(zacht). micrometer), fixeerde weefsels worden ingebed in
● Snijden:ingebed worden in paraffine, eerst hard materiaal (epoxyhars), coupes worden
ontdaan worden van alle water d.m.v. weefsel gesneden met een diamantmes of glasmes.
in oplopende alcoholoplossingen te plaatsen.
W dan uitgespoeld met tolueen of xyleen. Stalen kleuren: Door de 2de fixatie (met
Invriezen: osmiumtetroxide) kleuren de weefsels ook,
● moet zeer snel, enkel bij kleine weefselstukken. plaatsen waar veel osmium is gaan elektronen niet
● Ingevroren in een OCT oplossing (oplossing van makkelijk doorheen (donkere schaduw)
glycol en bepaalde soorten hars) adhv Om Specifieke moleculen aan te tonen →
onderkoeld isopentaan. immunolabeling met antistoffen met goud-labels
● Daarna w ze gesneden in vriescoupes met (weefsel wordt gebkleurs met een antistof waar
gekoeld microtoom. een goudpartikel aan hangt.
→ structuur van de eiwitten blijft ongewijzigd,
enzymatische werking w vertraagd/ stillgelegd, bij
ontdooing (37°) krijgen ze hun volledige fuctie terug
2. Het verwaardigen van weefselsneden
3. het kleuren v/d weefsels
, Resolutie: de
mogelijkheid v/e optisch
systeem om 2
nabijgelegen objecten
nog afzonderlijk weer te
geven.
2. Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Lichtmicroscoop:
● Verteringsprocessen worden afgeremd waardoor ook groei van micro-organismen stopt.
● Weefsel wordt ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator).
● Hierdoor worden covalente bindingen gevormd met N-terminale groepen van eiwitten,
volgens “crosslinking”.
→ Eiwitten worden zo aan cytoskelet en hun interagerende eiwitten vastgehecht.
● Meeste enzymen verliezen hun enzymatische werking.
● Duur varieert van 2h tot 24h, afhankelijk van grootte materiaal, en gebruikte methode van
fixatie en fixator. Hoeveelheid fixator minimaal 5x het volume van weefsel.
● Formol= waterige oplossing op basis van formaldehyde, meest gebruikte fixator.
Elektronenmicroscoop:
● Goede en snelle fixatie cruciaal.
● Kwaliteit afhankelijk van grootte weefselfragment gebruikte fixator.
● Fragmenten maximum 1-2 mm groot.
● In gekoelde (4°C) glutaaraldehyde.
● Gevolgd door 2e fixatie in osmiumtetroxide (OsO4) om vetten te bewaren (o.a. door oxidatie
van onverzadigde vetten).
→ deze voegt extra ‘gewicht’ toe aan welbepaalde locaties weefsel zodat deze beter zichtbaar
is in een elektronenmicroscoop.
→ kleurt het weefsel
,3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en immunofluorescentie.
4. Bespreek directe, indirecte en geamplificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Directe immunohistochemie:
● het primaire antistof wordt rechtstreeks gekoppeld aan het detectie-enzym.
● Techniek is snel en eenvoudig maar geeft weinig signaalversterking en lage
hoeveelheden AG worden veel moeilijker gedetecteerd.
→ om immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid- en nierbiopten
→ beste resultaat in vriescoupes
→ met label fluoresceïne
Indirecte immunohistochemie:
● secundaire antistof gericht tegen het FC-fragment van de primaire antistof, en dat gekoppeld
is aan het detectie-enzym.
● Voordeel is dat niet steeds de primaire antistof wordt gekoppeld. Dezelfde secundaire antistof
kan gebruikt worden tegen alle muis antilichamen.
● Ten tweede wordt er ook signaalversterking bekomen.
Geamplificeerde immunohistochemie:
● signaalversterking bekomen door gebruik van biotine streptavidine systeem.
- 2 stoffen die zeer sterk met elkaar interageren en grote complexen vormen.
- Meestal wordt het antistof met biotine gebonden en zal het detectie enzym wat ook
aan biotine is gebonden gecomplexeerd worden met streptavidine om zo een veel
hogere enzymactiviteit te bekomen, en dus ook een sterker signaal.
Immunofluorescentie:
● het primaire of secundaire AS wordt gekoppeld aan een fluorofoor die wanneer hij wordt
beschenen met licht van de juiste golflengte, fluorescent licht zal uitstralen
→ Er kunnen gemakkelijk verschillende AG op eenzelfde slide worden gevisualiseerd door
verschillende fluoroforen die verschillende kleuren licht uitzenden te gebruiken.
Deze methoden bestaan omdat elke methode verschilt in sensitiviteit, specificiteit, affiniteit van de
antistof en beschikbaarheid van de epitopen.
, 5. Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens
operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
a. Bewaring en fixering van weefsel
Fixatie: weefsel w ondergedompeld in fixatievloeistof (formol, waterige oplossing van
formaldehyde)
→ meeste enzymen verliezen enzymatische werking
→ materiaal kan niet direct gesneden worden (zacht). Om te snijden moet het ingebed worden in
paraffine, eerst ontdaan worden van alle water dmv weefsel in oplopende alcoholoplossingen te
plaatsen. W dan uitgespoeld met tolueen of xyleen.
Invriezen: moet zeer snel, enkel bij kleine weefselstukken. Ingevroren in een OCT oplossing
(oplossing van glycol en bepaalde soorten hars) adhv onderkoeld isopentaan. Daarna w ze gesneden
in vriescoupes met gekoeld microtoom.
→ structuur van de eiwitten blijft ongewijzigd, enzymatische werking w vertraagd/ stillgelegd,
bij ontdooing (37°) krijgen ze hun volledige fuctie terug
b. Vervaardigen van weefselsneden (coupes)
a) Versnijden en insluiten
b) Impregneren met paraffine
c) Gieten van de paraffineblok
d) Snijden van 2-5 micrometer coupes draagglaasjes monteren
c. Kleuren van de weefselsnedes
d. Afdekken
6. Antilichamen spelen een cruciale rol bij immunohistochemie: Bespreek de structuur van een
antilichaam en bespreek de gelijkenissen en verschillen tussen monoklonale & polyklonale
antistoffen.
