Histologie (Prof. F. De Smet)
Examenvragen (2025 – 2026)
Vraag 1: Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt
worden voor deze methoden en waarom?
Conventionele lichtmicroscopie
De lichtmicroscoop maakt voor de vergrootte
afbeelding gebruik van zichtbaar licht. De objecten
worden bekeken ofwel met licht dat op het object
zelf valt en weerkaatst wordt ofwel met door
vallend licht.
- Beperkte resolutie, details van bepaalde
structuren zijn maar beperkt zichtbaar,
resolutie is minder vanwege de golflengte
van het zichtbare licht, tot 0,2 µm.
- Vereist weinig monsterpreparatie (fixatie/invriezen/…).
Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
Elektronenmicroscopie maakt gebruik van een bundel elektronen om het
oppervlak of de inhoud van objecten af te beelden. Doordat versnelde
elektronen een veel kleinere golflengte hebben dan fotonen kan de resolutie
van een elektronenmicroscoop veel hoger zijn.
- TEM heeft een hogere resolutie dan conventionele lichtmicroscopie,
details van kleine structuren zijn hierdoor meer zichtbaar. Er kan naar
interne structuren van cellen en materialen op moleculaire niveau
gekeken worden, tot op 0,1 nm.
- Vereist uitgebreide monsterpreparatie, dun snijden en aanbrengen van
zware metalen kleuringen.
Vraag 2: Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Bij fixatie wordt het weefsel in een chemische oplossing geplaatst waardoor alle biochemische processen
worden stopgezet. Fixeren is een chemische reactie waarbij nieuwe verbindingen tussen biomoleculen
worden gevormd. Hierdoor blijft de ultrastructuur van het weefsel zo goed mogelijk behouden voor verdere
verwerking.
Fixatie a.d.h.v. formaldehyde
- Gebruik: vooral bij lichtmicroscopie (LM), inclusief standaard histologische kleuringen (H&E, PAS,
trichroom) en immunohistochemie.
- Doel: macromoleculaire structuren zo intact mogelijk houden zonder te sterke crosslinking.
- Het weefsel wordt ondergedompeld in formol (waterige oplossing van formaldehyde, meestal 4%
gebufferde formaldehyde = 10% neutral buffered formalin).
- Formaldehyde reageert met de N-terminale en zijketens van AZ -> vorming van milde
methyleenbruggen (crosslinks).
Hierdoor blijven veel antigenen herkenbaar, wat belangrijk is voor immunohistochemie.
Eiwitten worden gestabiliseerd en verankerd aan het cytoskelet en aan elkaar, waardoor de
weefselarchitectuur goed behouden blijft.
1
,Nadelen:
- De meeste enzymen verliezen hun activiteit door
denaturatie en crosslinking.
- DNA en RNA kunnen eveneens crosslinken, wat
leidt tot fragmentatie en bemoeilijkt moleculaire
technieken.
- Fixatie is relatief traag: 2 tot 24 uur, afhankelijk van
weefselgrootte.
Fixatie a.d.h.v. glutaaraldehyde
- Gebruik: vooral bij elektronenmicroscopie (EM), zowel transmissie-EM als scanning-EM.
- Reden: ultrastructuren (mitochondria, ER, membranen) moeten zeer snel en zeer stabiel gefixeerd
worden.
- Glutaaraldehyde is een dialdehyde en vormt veel sterkere en uitgebreidere crosslinks dan
formaldehyde.
- Fixatie gebeurt snel om osmotische zwelling van organellen te voorkomen, dit begint al minuten na
scheiding van de bloedvoorziening.
- Eerste fixatie: gekoelde glutaaraldehyde voor snelle en sterke
eiwitfixatie.
- Tweede fixatie: osmiumtetroxide (OsO4)
Reageert met lipiden, stabiliseert membranen.
Osmium is zwaar, verhoogt elektrondensiteit en
membranen worden zichtbaar in de
elektronenmicroscoop.
Opmerking: glutaaraldehyde is minder geschikt voor
immunohistochemie omdat het antigenen vaak te sterk maskeert.
Vraag 3: Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er gebruik
gemaakt van directe, indirecte en geamplificeerde immunohistochemie en immunofluorescentie.
Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Immuunhistochemie is een techniek om specifieke eiwitten (antigenen) in weefselcoupes aan te tonen. Het
berust op het principe dat antilichamen zich specifiek binden aan bepaalde antigenen in weefsels of cellen.
Directe immunohistochemie
De directe methode gebruikt een gelabeld antistof om een specifiek antigeen op te sporen. Ze is snel en
eenvoudig, maar geeft weinig signaalversterking, waardoor lage antigeen hoeveelheden mogelijk
detecteerbaar zijn.
Indirecte immunohistochemie
2
,Het specifieke antilichaam is niet gelabeld, dit is het primaire antilichaam. Na incubatie wordt er op de
coupe een secundair antilichaam aangebracht. Dit is wel gelabeld en is gericht tegen immuunglobulines
van dezelfde diersoort als waarin het primaire antilichaam werd opgewekt
Voordelen:
- Gevoeliger: omdat meerdere secundaire antilichamen op één primair antilichaam kunnen binden,
wat het signaal versterkt. Hoe meer labels per antilichaam-antigeen binding mogelijk zijn, hoe
gevoeliger de techniek en hoe minder primaire antilichamen nodig zijn, wat bovendien de
specificiteit verhoogt en het risico op kruisreacties verkleint.
- Grotere flexibiliteit: het gelabelde antilichaam kan op elk primair antilichaam reageren.
- Kostprijs: die daalt per test doordat er minder antilichamen nodig zijn.
Geamplificeerde immunohistochemie
Geamplificeerde immunohistochemie omvat geavanceerde detectiemethoden die zijn ontworpen om de
sensitiviteit van standaard IHC-protocollen te verhogen. Deze technieken maken de visualisatie van
antigenen met een zeer lage expressie mogelijk, wat essentieel is voor zowel complexe diagnostiek als
biomedisch onderzoek.
Immunofluorescentie
Immunofluorescentie maakt gebruik van antilichamen die gekoppeld zijn aan een fluorochroom om
specifieke eiwitten in een weefsel of cel zichtbaar te maken. Het antilichaam bindt aan zijn antigeen, en het
fluorochroom licht op wanneer het wordt aangestraald met licht van een bepaalde golflengte. Zo ontstaat
een helder fluorescent signaal dat onder de fluorescentiemicroscoop kan worden waargenomen. Omdat
verschillende fluorochromen verschillende kleuren uitzenden, kunnen meerdere antigenen tegelijk worden
gedetecteerd.
Vraag 4: Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens een
operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
1. Operatieve verwijdering van het weefsel
Het weefsel wordt chirurgisch verwijderd. Op dat moment is het nog vitaal en moeten de cellulaire
structuren zo snel mogelijk worden gestabiliseerd om autolyse en degradatie te voorkomen.
2. Eerste verwerking: keuze tussen invriezen of fixeren
a) Invriezen (voor snelle vriescoupes)
Het weefsel wordt zeer snel ingevroren, meestal met vloeibare stikstof of isopentaan. Hoe
sneller het invriest, hoe beter de morfologie behouden blijft.
b) Fixeren (voor standaard histologie)
Het weefsel wordt ondergedompeld in een fixatief, meestal formaldehyde. Dit stabiliseert
eiwitten en voorkomt autolyse.
3
, 3. Verdere verwerking afhankelijk van de gekozen methode
a) Na invriezen -> cryotoom
Het ingevroren weefsel wordt in een cryomatrix geplaatst en in een cryotoom gesneden tot
dunne coupes. Deze worden direct gekleurd (bv. H&E of immunofluorescentie).
b) Na fixatie -> paraffineverwerking
Het weefsel doorloopt een standaard histologisch proces:
- Dehydratie: het gefixeerde weefsel wordt door oplopende alcoholreeksen gehaald om water
te verwijderen.
- Clearing: alcohol wordt vervangen door een organisch oplosmiddel (xyleen) dat mengbaar
is met parafine.
- Inbedden in paraffine: het
weefsel wordt
doorgedrongen met
vloeibare paraffine en in
een blok gegoten.
- Snijden: met een
mircotoom worden dunne
coupes (3 – 5 µm)
gesneden en op glaasjes
geplaatst.
4. Kleuren
a) Hematoxyline – eosine kleuring
b) Immunohistochemische kleuring
Vraag 5: Geef een overzicht van de verschillende types kleuringen die courant gebruikt worden in
de histologie? Leg kort principe en doel van de diverse types kleuringen uit. Met welke methode
zou je een delende cel kunnen identificeren?
Hematoxyline – eosine Principe Hematoxyline is een basische kleurstof die bindt aan zure cel
kleuring componenten, vooral DNA in de kern. Het is zelf kleurloos, maar
zijn oxidatieproduct hemateïne kleurt blauw.
Eosine is een zure kleurstof die bindt aan basische
componenten, voornamelijk in het cytoplasma.
Doel Zure structuren (kern, ruw ER) kleuren blauw; basische
structuren (cytoplasma, extracellulaire eiwitten) kleuren rood. Dit
is de standaard basiskleuring voor algemene weefselmorfologie.
Empirische kleuring Principe Kleuring o.b.v. de lading en chemische affiniteit van kleurstoffen
voor bepaalde weefselcomponenten. Deze kleurstoffen zijn
historisch afkomstig uit de stoffenindustrie.
Doel Verschillende weefselcomponenten onderscheiden door
contrasterende kleuren.
Vb.:
- Trichroomkleuring: onderscheid collageen <=> spier
- Zilverkleuring: reticuline vezels, zenuwvezels
Histochemische Principe Een specifieke chemische reactie tussen een
kleuring weefselcomponent en een reagens in de kleuroplossing. De
reactie vormt een gekleurd neerslag.
Doel Aanwezigheid van chemische stoffen aantonen.
Vb.: PAS-kleuring (Periodic Acid-Schiff) voor polysachariden,
glycogeen, mucinen, basale membranen.
4
Examenvragen (2025 – 2026)
Vraag 1: Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM).
Wat kan je met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt
worden voor deze methoden en waarom?
Conventionele lichtmicroscopie
De lichtmicroscoop maakt voor de vergrootte
afbeelding gebruik van zichtbaar licht. De objecten
worden bekeken ofwel met licht dat op het object
zelf valt en weerkaatst wordt ofwel met door
vallend licht.
- Beperkte resolutie, details van bepaalde
structuren zijn maar beperkt zichtbaar,
resolutie is minder vanwege de golflengte
van het zichtbare licht, tot 0,2 µm.
- Vereist weinig monsterpreparatie (fixatie/invriezen/…).
Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
Elektronenmicroscopie maakt gebruik van een bundel elektronen om het
oppervlak of de inhoud van objecten af te beelden. Doordat versnelde
elektronen een veel kleinere golflengte hebben dan fotonen kan de resolutie
van een elektronenmicroscoop veel hoger zijn.
- TEM heeft een hogere resolutie dan conventionele lichtmicroscopie,
details van kleine structuren zijn hierdoor meer zichtbaar. Er kan naar
interne structuren van cellen en materialen op moleculaire niveau
gekeken worden, tot op 0,1 nm.
- Vereist uitgebreide monsterpreparatie, dun snijden en aanbrengen van
zware metalen kleuringen.
Vraag 2: Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Bij fixatie wordt het weefsel in een chemische oplossing geplaatst waardoor alle biochemische processen
worden stopgezet. Fixeren is een chemische reactie waarbij nieuwe verbindingen tussen biomoleculen
worden gevormd. Hierdoor blijft de ultrastructuur van het weefsel zo goed mogelijk behouden voor verdere
verwerking.
Fixatie a.d.h.v. formaldehyde
- Gebruik: vooral bij lichtmicroscopie (LM), inclusief standaard histologische kleuringen (H&E, PAS,
trichroom) en immunohistochemie.
- Doel: macromoleculaire structuren zo intact mogelijk houden zonder te sterke crosslinking.
- Het weefsel wordt ondergedompeld in formol (waterige oplossing van formaldehyde, meestal 4%
gebufferde formaldehyde = 10% neutral buffered formalin).
- Formaldehyde reageert met de N-terminale en zijketens van AZ -> vorming van milde
methyleenbruggen (crosslinks).
Hierdoor blijven veel antigenen herkenbaar, wat belangrijk is voor immunohistochemie.
Eiwitten worden gestabiliseerd en verankerd aan het cytoskelet en aan elkaar, waardoor de
weefselarchitectuur goed behouden blijft.
1
,Nadelen:
- De meeste enzymen verliezen hun activiteit door
denaturatie en crosslinking.
- DNA en RNA kunnen eveneens crosslinken, wat
leidt tot fragmentatie en bemoeilijkt moleculaire
technieken.
- Fixatie is relatief traag: 2 tot 24 uur, afhankelijk van
weefselgrootte.
Fixatie a.d.h.v. glutaaraldehyde
- Gebruik: vooral bij elektronenmicroscopie (EM), zowel transmissie-EM als scanning-EM.
- Reden: ultrastructuren (mitochondria, ER, membranen) moeten zeer snel en zeer stabiel gefixeerd
worden.
- Glutaaraldehyde is een dialdehyde en vormt veel sterkere en uitgebreidere crosslinks dan
formaldehyde.
- Fixatie gebeurt snel om osmotische zwelling van organellen te voorkomen, dit begint al minuten na
scheiding van de bloedvoorziening.
- Eerste fixatie: gekoelde glutaaraldehyde voor snelle en sterke
eiwitfixatie.
- Tweede fixatie: osmiumtetroxide (OsO4)
Reageert met lipiden, stabiliseert membranen.
Osmium is zwaar, verhoogt elektrondensiteit en
membranen worden zichtbaar in de
elektronenmicroscoop.
Opmerking: glutaaraldehyde is minder geschikt voor
immunohistochemie omdat het antigenen vaak te sterk maskeert.
Vraag 3: Bespreek de algemene principes van immuunhistochemie. Waarom wordt er gebruik
gemaakt van directe, indirecte en geamplificeerde immunohistochemie en immunofluorescentie.
Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Immuunhistochemie is een techniek om specifieke eiwitten (antigenen) in weefselcoupes aan te tonen. Het
berust op het principe dat antilichamen zich specifiek binden aan bepaalde antigenen in weefsels of cellen.
Directe immunohistochemie
De directe methode gebruikt een gelabeld antistof om een specifiek antigeen op te sporen. Ze is snel en
eenvoudig, maar geeft weinig signaalversterking, waardoor lage antigeen hoeveelheden mogelijk
detecteerbaar zijn.
Indirecte immunohistochemie
2
,Het specifieke antilichaam is niet gelabeld, dit is het primaire antilichaam. Na incubatie wordt er op de
coupe een secundair antilichaam aangebracht. Dit is wel gelabeld en is gericht tegen immuunglobulines
van dezelfde diersoort als waarin het primaire antilichaam werd opgewekt
Voordelen:
- Gevoeliger: omdat meerdere secundaire antilichamen op één primair antilichaam kunnen binden,
wat het signaal versterkt. Hoe meer labels per antilichaam-antigeen binding mogelijk zijn, hoe
gevoeliger de techniek en hoe minder primaire antilichamen nodig zijn, wat bovendien de
specificiteit verhoogt en het risico op kruisreacties verkleint.
- Grotere flexibiliteit: het gelabelde antilichaam kan op elk primair antilichaam reageren.
- Kostprijs: die daalt per test doordat er minder antilichamen nodig zijn.
Geamplificeerde immunohistochemie
Geamplificeerde immunohistochemie omvat geavanceerde detectiemethoden die zijn ontworpen om de
sensitiviteit van standaard IHC-protocollen te verhogen. Deze technieken maken de visualisatie van
antigenen met een zeer lage expressie mogelijk, wat essentieel is voor zowel complexe diagnostiek als
biomedisch onderzoek.
Immunofluorescentie
Immunofluorescentie maakt gebruik van antilichamen die gekoppeld zijn aan een fluorochroom om
specifieke eiwitten in een weefsel of cel zichtbaar te maken. Het antilichaam bindt aan zijn antigeen, en het
fluorochroom licht op wanneer het wordt aangestraald met licht van een bepaalde golflengte. Zo ontstaat
een helder fluorescent signaal dat onder de fluorescentiemicroscoop kan worden waargenomen. Omdat
verschillende fluorochromen verschillende kleuren uitzenden, kunnen meerdere antigenen tegelijk worden
gedetecteerd.
Vraag 4: Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens een
operatie en diagnostiek middels lichtmicroscopie? Licht iedere stap kort toe.
1. Operatieve verwijdering van het weefsel
Het weefsel wordt chirurgisch verwijderd. Op dat moment is het nog vitaal en moeten de cellulaire
structuren zo snel mogelijk worden gestabiliseerd om autolyse en degradatie te voorkomen.
2. Eerste verwerking: keuze tussen invriezen of fixeren
a) Invriezen (voor snelle vriescoupes)
Het weefsel wordt zeer snel ingevroren, meestal met vloeibare stikstof of isopentaan. Hoe
sneller het invriest, hoe beter de morfologie behouden blijft.
b) Fixeren (voor standaard histologie)
Het weefsel wordt ondergedompeld in een fixatief, meestal formaldehyde. Dit stabiliseert
eiwitten en voorkomt autolyse.
3
, 3. Verdere verwerking afhankelijk van de gekozen methode
a) Na invriezen -> cryotoom
Het ingevroren weefsel wordt in een cryomatrix geplaatst en in een cryotoom gesneden tot
dunne coupes. Deze worden direct gekleurd (bv. H&E of immunofluorescentie).
b) Na fixatie -> paraffineverwerking
Het weefsel doorloopt een standaard histologisch proces:
- Dehydratie: het gefixeerde weefsel wordt door oplopende alcoholreeksen gehaald om water
te verwijderen.
- Clearing: alcohol wordt vervangen door een organisch oplosmiddel (xyleen) dat mengbaar
is met parafine.
- Inbedden in paraffine: het
weefsel wordt
doorgedrongen met
vloeibare paraffine en in
een blok gegoten.
- Snijden: met een
mircotoom worden dunne
coupes (3 – 5 µm)
gesneden en op glaasjes
geplaatst.
4. Kleuren
a) Hematoxyline – eosine kleuring
b) Immunohistochemische kleuring
Vraag 5: Geef een overzicht van de verschillende types kleuringen die courant gebruikt worden in
de histologie? Leg kort principe en doel van de diverse types kleuringen uit. Met welke methode
zou je een delende cel kunnen identificeren?
Hematoxyline – eosine Principe Hematoxyline is een basische kleurstof die bindt aan zure cel
kleuring componenten, vooral DNA in de kern. Het is zelf kleurloos, maar
zijn oxidatieproduct hemateïne kleurt blauw.
Eosine is een zure kleurstof die bindt aan basische
componenten, voornamelijk in het cytoplasma.
Doel Zure structuren (kern, ruw ER) kleuren blauw; basische
structuren (cytoplasma, extracellulaire eiwitten) kleuren rood. Dit
is de standaard basiskleuring voor algemene weefselmorfologie.
Empirische kleuring Principe Kleuring o.b.v. de lading en chemische affiniteit van kleurstoffen
voor bepaalde weefselcomponenten. Deze kleurstoffen zijn
historisch afkomstig uit de stoffenindustrie.
Doel Verschillende weefselcomponenten onderscheiden door
contrasterende kleuren.
Vb.:
- Trichroomkleuring: onderscheid collageen <=> spier
- Zilverkleuring: reticuline vezels, zenuwvezels
Histochemische Principe Een specifieke chemische reactie tussen een
kleuring weefselcomponent en een reagens in de kleuroplossing. De
reactie vormt een gekleurd neerslag.
Doel Aanwezigheid van chemische stoffen aantonen.
Vb.: PAS-kleuring (Periodic Acid-Schiff) voor polysachariden,
glycogeen, mucinen, basale membranen.
4
