Genetica en evolutie DT2
25-11-2019
H10 Gen-isolatie en genetische manipulatie
Genetisch engineering = het proces van het produceren van gemodificeerd DNA en
het opnieuw introduceren van dit DNA in gastheerorganismen.
Amplificeren kan in virto en in vivo
Vitro = in een reageerbuis. Dit heet de polymerase chain reaction (PCR). Een
specifiek gen of DNA gebied wordt geïsoleerd en versterkt door polymerase
(uit een bacterie). PCR vindt het target DNA door de complementaire binding
van primers -> replicatie wordt ingezet.
Vivo = in levende bacterie cellen
Hebben familieleden van een patiënt met een erfelijke aandoening de zelfde
genotypische predispositie?
We zoeken dus een bekende mutatie in een gen (mutatie in patiënt is bekend)
waar we de sequentie van kennen.
1. DNA extractie van de familieleden en DNA isolatie = componenten van de cel
verwijderen en DNA overhouden.
2. Gebruik PCR om de mutatie te detecteren.
Denaturatie = Temp verhoogt tot 95 graden -> waterstofbruggen breken
-> twee aparte strengen
Hybridisatie = lagere temp 50 graden -> bindt primer.
Elongatie = 72 graden -> DNA polymerase bindt (TAQ) -> DNA
replicatie
Target sequence -> gedeelte van primer 1 naar primer 2
Proces begint opnieuw en herhaalt onwijs vaak
Is de mutatie groot -> zet je PCR product op gel
Mutatie klein -> ontwikkel een selectie primer voor de deletie/snp ->
wildtype zal geen PCR product hebben en mutant wel -> zet PCR
fragmenten op gel
Wetenschappers isoleren DNA voor:
- Genetisch testen
- Lichaam identificatie
- Analyse van forensisch onderzoek
Oxydroinen gen maken
Restrictie-enzymen = eiwitten die DNA kunnen knippen
Moleculaire scharen met een specifieke ‘knip’
Structuur van de geknipte producten:
- Met overhang
- Blunt ends
Transfectie = DNA in andere cellen brengen
, Welke genen komen tot expressie tijdens het vormen van langetermijngeheugen?
Als je eiwitsynthese blokkeert in bv fruitvliegjes, kunnen ze nog wel leren, maar slaat
het niet op in het langetermijngeheugen.
We willen onderzoeken welke genen meer en minder worden afgeschreven
tijdens de vorming van LTM (longterm memory)
1. mRNA extractie
2. cDNA synthese wanneer we al het mRNA willen onderzoeken (reverse
transcriptie). 2 soorten primers
poly T primer = op de poly A staart. Hiermee gebruik je het hele mRNA
specifieke primer = als je een specifiek deel van het mRNA wilt
3. Productie gelabeld cDNA -> tijdens PCR worden er gelabelde dNTP’s
gebruikt. dNTPS’s = de losse basen nodig tijdens PCR. Bv geen LTM is groen
en wel LTM is rood.
4. Micro array = hiermee kan het verschil in genexpressie tussen behandelingen
worden vergeleken.
Hoe kunnen we een mogelijke nieuwe mutatie opsporen?
1. Zoek het gen waar de mutatie zich zou kunnen bevinden op in het humane
genoom
2. Amplificeer het gen
Ontwerp primers om het gen te amplificeren met PCR
Of kloneer het gen in een bacterie
3. Bepaal de basenvolgorde van het gen (sequencing)
Sanger sequencing = techniek die relatief lange “reads” van goede kwaliteit
geeft
CRISPR-CAS9
Gericht mutaties aanbrengen.
Belangrijkste toepassingen
- Gene knock-out maken
- Site directed mutagenese -> puntmutaties, grotere mutaties
- Regulatie genexpressie -> activatie, repressie
- Epigenetische modificaties
- Genome labeling
- RNA silencing
26-11-2019
H14 genomen en genomics
Frederick Sanger -> uitvinder van radioactief Sanger
sequencing
Ddntp’s = nucleotiden die dideoxyribose bevatten (H in
plaats van OH op c3). Na inbouwen van het ddntp kan
de DNA keten niet langer verlengt worden, omdat er
geen andere nucleotide aan kan binden aan c3.
Sequencing reactie is een PCR reactie. De PCR stopt
na het inbouwen van een ddntp. Zo kan de volgorde van
de basenparen bepaald worden.
25-11-2019
H10 Gen-isolatie en genetische manipulatie
Genetisch engineering = het proces van het produceren van gemodificeerd DNA en
het opnieuw introduceren van dit DNA in gastheerorganismen.
Amplificeren kan in virto en in vivo
Vitro = in een reageerbuis. Dit heet de polymerase chain reaction (PCR). Een
specifiek gen of DNA gebied wordt geïsoleerd en versterkt door polymerase
(uit een bacterie). PCR vindt het target DNA door de complementaire binding
van primers -> replicatie wordt ingezet.
Vivo = in levende bacterie cellen
Hebben familieleden van een patiënt met een erfelijke aandoening de zelfde
genotypische predispositie?
We zoeken dus een bekende mutatie in een gen (mutatie in patiënt is bekend)
waar we de sequentie van kennen.
1. DNA extractie van de familieleden en DNA isolatie = componenten van de cel
verwijderen en DNA overhouden.
2. Gebruik PCR om de mutatie te detecteren.
Denaturatie = Temp verhoogt tot 95 graden -> waterstofbruggen breken
-> twee aparte strengen
Hybridisatie = lagere temp 50 graden -> bindt primer.
Elongatie = 72 graden -> DNA polymerase bindt (TAQ) -> DNA
replicatie
Target sequence -> gedeelte van primer 1 naar primer 2
Proces begint opnieuw en herhaalt onwijs vaak
Is de mutatie groot -> zet je PCR product op gel
Mutatie klein -> ontwikkel een selectie primer voor de deletie/snp ->
wildtype zal geen PCR product hebben en mutant wel -> zet PCR
fragmenten op gel
Wetenschappers isoleren DNA voor:
- Genetisch testen
- Lichaam identificatie
- Analyse van forensisch onderzoek
Oxydroinen gen maken
Restrictie-enzymen = eiwitten die DNA kunnen knippen
Moleculaire scharen met een specifieke ‘knip’
Structuur van de geknipte producten:
- Met overhang
- Blunt ends
Transfectie = DNA in andere cellen brengen
, Welke genen komen tot expressie tijdens het vormen van langetermijngeheugen?
Als je eiwitsynthese blokkeert in bv fruitvliegjes, kunnen ze nog wel leren, maar slaat
het niet op in het langetermijngeheugen.
We willen onderzoeken welke genen meer en minder worden afgeschreven
tijdens de vorming van LTM (longterm memory)
1. mRNA extractie
2. cDNA synthese wanneer we al het mRNA willen onderzoeken (reverse
transcriptie). 2 soorten primers
poly T primer = op de poly A staart. Hiermee gebruik je het hele mRNA
specifieke primer = als je een specifiek deel van het mRNA wilt
3. Productie gelabeld cDNA -> tijdens PCR worden er gelabelde dNTP’s
gebruikt. dNTPS’s = de losse basen nodig tijdens PCR. Bv geen LTM is groen
en wel LTM is rood.
4. Micro array = hiermee kan het verschil in genexpressie tussen behandelingen
worden vergeleken.
Hoe kunnen we een mogelijke nieuwe mutatie opsporen?
1. Zoek het gen waar de mutatie zich zou kunnen bevinden op in het humane
genoom
2. Amplificeer het gen
Ontwerp primers om het gen te amplificeren met PCR
Of kloneer het gen in een bacterie
3. Bepaal de basenvolgorde van het gen (sequencing)
Sanger sequencing = techniek die relatief lange “reads” van goede kwaliteit
geeft
CRISPR-CAS9
Gericht mutaties aanbrengen.
Belangrijkste toepassingen
- Gene knock-out maken
- Site directed mutagenese -> puntmutaties, grotere mutaties
- Regulatie genexpressie -> activatie, repressie
- Epigenetische modificaties
- Genome labeling
- RNA silencing
26-11-2019
H14 genomen en genomics
Frederick Sanger -> uitvinder van radioactief Sanger
sequencing
Ddntp’s = nucleotiden die dideoxyribose bevatten (H in
plaats van OH op c3). Na inbouwen van het ddntp kan
de DNA keten niet langer verlengt worden, omdat er
geen andere nucleotide aan kan binden aan c3.
Sequencing reactie is een PCR reactie. De PCR stopt
na het inbouwen van een ddntp. Zo kan de volgorde van
de basenparen bepaald worden.
