Overzichtstabel analysetechnieken
zaterdag 30 mei 2026 05:29
Analyse Werkingsmechanisme Lichtbron Golflengteselector Staalvorm: blanco/analiet Detector Extra onderdelen Toepassingen
techniek
Refractometer Adhv de breking van licht (volgenss wet van snellius) de grenshoek bepalen. Door totale weerkaatsing zal de grenshoek zichtbaar zijn in het oculair Monochromatisch ligt gebruiken aangezien de brekingsinde Oculair: scheiding tussen licht en donker aflezen - Kwantitatieve analyses van eenvoudige/enkelvoudige oplossingen
(van Abbé) - Druppel monster uitgesmeerd tussen 2 prismas afhankelijk is van de kleur van het licht een schaalverdeling geeft de n weer - Kwaliteitscontrole
- Prisma is optisch dichter dan het staal --> breking naar N toe - Verlichtend prisma - Opvolging rijpingsproces fruit
○ Grenshoek is dus altijd kleiner dan de invalshoek • Verlicht door externe lichtbroen (vb gloeilamp) - Urine onderzoek, bloed analyses,…
- Kijken naar hoe breking van licht gebeurt op punt A • Heeft ruw onderste oppervlak zodat het staal uit alle
- Kijker verdraaien tov prisma tot scheiding tussen licht en donker zichtbaar is mogelijke richtingen belicht wordt
○ Scheiding is wazig kleurenspectrum (want grenshoek en brekingsindex zijn kleurafhankelijk) als met wit licht wordt gewerkt
§ Oplossen door "compenserende prismas" te gebruiken
-
- Licht laten invallen langs onderste prisma
- men kan ook zonder verlichtend prisma werken!
- N is T afhankelijk (n daalt als T stijgt) meestal bij 20-25°C
Brekingsindexen worden vaan weergegeven in %Brix (vb 20%Brix= zelfde n als een oplossing met 20g sucrose en 80g water)
• Minder scherp contrast omdat de het doorgelaten licht ook
deels wordt weerkaatst
Moleculaire Elke stof absorbeert EM straling met specifieke frequenties (afspiegeling van de orbitaalstructuur van een molecule--> vingerafdruk van een stof) Continue lichtbronnen: zenden veel golflengten uit - Filter - Rechthoekig buisje met lengte x waarin A of B zit Gemeten stralingsenergie wordt omgezet in een elektrisch signaal Bij dubbelstraal: - Conc berekenen door een ijklijn met ijkoplossingen op te stellen volgens de wet
absoprtie --> identificatie mogelijk door een absorptiespectrum op te stellen --> meestal Obv verhitten van eend raagd tot roodgloeihtte waardoor • Gekleurd glas: absorptiefilter - De cuvet zal de I0 verminderen (cuvet met oplosmiddel absorbeert - Roterende spiegel van Lambert-Beer en dan de A onbekende hier op te interpoleren
spectrofotome deze EMS uitzend - Monochromator ook een deen van het licht) - Fotovoltaïsche cel (= grenslaagcel of fotocel) - Beam splitter - Gebruik van kleurreacties voor de bepaling van fosfor/melkzuur/beta-
trie - Gloeilamp/ wolfraamlamp • Reflectierooster - Licht kan ook weerkaatsen of via diffusie verloren gaan ○ Eenvoudig caroteen/vit C in levensmiddelen
Volgens de wet van Lambert-Beer is er een lineair verband tussen concentratie en absorptie: A= ɛ*c*x ○ ZL en nabije IR (350-2500nm) • Transmissierooster --> oplossen door gebruik te maken van een BLANCI ○ Platte elektrode uit Fe of Cu met een dunne laag halfgeleider (Se of Cu2O) die weer bedekt is met een dun laagje Bij IR - Bestanddelen aantonen door specifieke werking van een enzym
--> door een ijklijn op te stellen met ijkoplossingen kan een onbekende concentratie worden bepaald adhv de absorptie en interpolatie in deze ijklijn - Waterstoflamp/deuteriumlamp • Prisma = zelfde cuvet, met zelfde oplosmiddel en dezelfde reagentia (transparant) sterk geleidend materiaal (Au, Ag, Pb)= collectorelektrode - IR lamp • Veel enzymes katalyseren rea enkel als NADH en/of ATP aanwezig zijn
- Bij het opstellen van de ijklijn werken met golflengte met max absorptie aangezien de stof andere golflengten niet absorbeert ○ Cilindrische kwartsbuis(UV) met deuterium of waterstof ○ Als EMS op Se invalt--> e- vrij--> worden opgevangen door dunne laagje metaal op Se ○ NADH en NAD+ hebben andere absorptiespectra --> evenredig met
bij lage druk Probleem: monochromators kunnen meestal niet exact 1 golflengte uitzenden, ○ Er ontstaat een spanning tss metaal en drager elektrode--> elektrische stroom --> meten comp (bv glucose)
○ Door een aangelegde spanning worden de gasmoleculen wel een beperkt golflengtegebied = bandenspectrum - Standaart worden glazen/ plastieken cuvetten gebruikt § Minder gevoelig--> vermoeid, kan niet met monochromator worden gebruikt want I is te klein
geëxiteerd--> zenden bij terugval licht uit - Bandreedte moet smaller zijn dan de absorptiepiek om het lineaire verband - Voor metingen in UV licht ( 350nm>) kwarts cuvetten gebruiken § Goedkoop en stevig
○ 160-380 nm goed te kunnen weergeven
- Kwiklampen • Alle uitgezonden golflengten zullen dan worden opgenomen, er is geen
○ Zelfde werking als waterstof/deuteriumlamp maar zendt storend licht
enkel lijnenspectrum van kwikdamp uit - Als de bandbreedte wel breder is dan de absorptiepiek, is er last van storing
§ Niet geschikt voor absorptiemetingen
§ Wel bruikbaar bij kwantitatieve abs metingen met -
vaste golflengten van een vd kwiklijnen
• Hierdoor zal de wet van Lambert-Beer gaan afwijken bij een hogere
concentratie
○ Enkel bij hogere conc aangezien de I bij lage conc nog vrij hoog zal
Lijnbronnen: zenden maar een beperkt aantal golflengtes
zijn end e invloed van Is minimaal is, hoe hoger de concentratie, hoe
kleiner de I, dus hoe meer invloed Is zal hebben - Fotobuis (= foto-elektrische cel of vacuüm cel)
○ Luchtledige glazen buis (ev met kwartsvenster)
○ Kathode in de vomr van een halfcilinder bedekt met een alkalymetaal of metaaloxide --> e- kunenn worden vrijgesteld
als EMS kathode bereikt
○ Staarformige anode
•
○ Over anode en kathode loopt spanning: als e- worden vrijgesteld uit kathode --> aangetrokken door anode
soort werking Uitleg ○ Er ontstaat een zwakke elektrische stroom evenredig met de ingevallen lichtintensiteit
spectroscoop - Polychromatisch licht bundelen met lens
- Licht valt in op twee prisma's --> breking
- Volledig kleurenspectrum zichtbaar
- Een gekleure opl zal bepaalde golflengten absorberen --> donkere banden
Geeft de absorptielijnen weer
enkelstraal 1 lichtbundel aanwezig
Als golflengteselector = filter = colorimeter
Nadeel: door tijd die verloopt tussen analyse blanco en analiet kunnen fluctuaties in lichtintensiateit optreden - Fotovermenigvuldigingsbuis = uitbreiding van de fotobuis
○ Tussen kathode en anode zitten meerdere elektroden (genaamd dynoden) die progressief op een hogere potentiaal
--> opgelost door gebruik te maken van een dubbelstraal spectrofotometer worden gehouden
○ Als EMS e- vrijmaakt uit de kathode bedekt met alkalimetaal --> aangetrokken door de secundaire dynode
○ Door de snelheid waarmee de elektronen aankomen, worden er meer elektronen vrijgesteld
○ Deze worden weer aangetrokken door de volgende dynode op een iets hogere potentiaa
○ Dit process herhaalt zich tot de oorspronkelijke kathodestroom 10^6 x versterkt is
○ Deze stroom wordt gemeten en om
○
○ gezet tot een elektrisch signaal
§ Grote gevoeligheid
dubbelstraal Splitsing van lichtstraal waardoor analiet en blanco tegelijk kunnen worden gemeten
- Roterende spiegel
- Beamsplitter (V-vormige spiegel) ○
○ Bij deze optie moet men gebruik maken van 2 detectoren
infrarood - Gebruikt een IR lamp
- Organische, anorganische en biologische bindingen identificeren
Fotonen uit IR geboed (2,5-15μm) hebben de geschikte energie om trillingen die atomen uitvoeren rond hun evenwichtspositie te
veranderen
--> bekomen absorptiespectra vertonen zo absorptiebanden die overeenkomen met specifieke functies
Atomaire Atomen absorberen bepaalde golflengte van EMS--> met wet van Lambert-Beer kan men kwantificeren Holle kathodelamp - Meestal rooster: voornaamste lijn van het emissiespectrum van de holle - Fotovermenigvuldigingsbuis omdat signaalverschil tussen analiet en blanco heel klein is ATOMISATOR Dosering van:
absorptie - Glazen omhulling met kwartsvenster kathodelamp afzonderen - Vlam - Ca
spectrofotome - Ar gas onder lage druk ○ Monster opzuigen door perslucht - Mg
trie - Anode= wofraamdraadje dat door glaswand steekt ○ Verstuiven als fijne nevel in verstuiver - Fe
- Kathode: hol en gemaakt uit het te bepalen element (vb Na) ○ In de vlam verdampt het SOLVENT= desolventatie - Zn
- Er wordt een spanning aangelegd --> ar wordt geïoniseerd --> ○ Vaste monsterdeeltjes ontstaan - Cu
bombarderen kathode ○ Door hoge T worden de metaal ionen omgezet in metaal atomen - Mn
- Doordat de kathode wordt gebombardeerd worden - Grafietoven - Na
metaalatomen losgerukt, sommige zijn geëxciteerd ○ Enkele μl in een laatje op de oven - K
- Geëxiteerde metaal atomen vallen terug naar gronddtoestand ○ Solvent wordt verdampt
en zenden zo lijnenspectrum van het te bepalen element uit • T heel snel opgedreven waardoor de achtergebleven vaste stof heel snel atomiseert in de gasfase
Er kunnen veel lijnen worden uitgezonden, zeker als kathode bedekt CHOPPER
is met een legering --> monochromator nodig Onderscheid maken tussen straling afkomstig van de holle kathodelamp en straling afkomstig van de vlam
- Groot deel van licht van de vlam wordt geëlimineerd door monochromator
- Sommige atomen raken in de vlam geëxciteerd door de hoge hitte: zullen ook straling uitzenden!
- Als het lichtsignaal van de holle kathodelamp wordt gemoduleerd, kunnen deze problemen worden verholpen
- R
-
- oterende sectorschijf--> geeft in de detector een wisselstroom ipv gelijkstroom
'
Atomaire Analyse van elementen obv hun uitgezonden lijnen spectrum door lichtemissie Vlam = lichtbron en atomisator/excitator! Resonantielijn van het te analyseren element selecteren en andere golflengten Hoge conc: fotocel ATOMISATOR Bepaling van alkali en aardalkalimetalen
emissie - Atomen worden geëxciteerd door aanvoer van energie (uitgezonden door andere elementen) tegenhouden - Vlam Vb:
spectrofotome - Bij terugkeer naar hun gronddtoestand zenden ze energie uit Lage conc: vacuümfotocel of fotovermenigvuldigingsbuis ○ Staal door perslucht meegezogen naar de mengkamer - Na en K in planten en fruit
trie / - Elk atoom zend een specifiek lijnen spectrum uit (karakteristiek lijnenspectrum in ZL en UV) Filter of monochromator ○ Staal wordt vertsoven tot een fijne nevel/spray --> met perslucht meegzeogen naar de vlam
Vlamfotometri Opletten bij hoge conc: kans op zelfabsorptie ○ Druppels slaan neer op wanden van de mengkamer --> worden gedraineerd
e - Straling die door atomen uit A worden uitgezonden, worden opgenomen door andere atomen uit het analiet, waardoor de gemeten emissie intensiteit verzwakt ○ Saal onderweg naar vlam vermengen met brandgas (vb acetyleen of propaan)
- De ijklijn zal hierdoor afbuigen bij hoge concentraties ○ Vlam atomatiseert het staal en levert de energie om de atomen te exciteren
○ T tussen 1000-3000°C
○ Enkel KWANTITATIEVE analyses (vlamfotometrie)
- Heet plasma= ICP= inductief gekoppelde plasma ontlading
○ Plasma= geleidend gas
§ = gas dat naast atomen en moleculen ook een substantiële fractie aan ionen en elektronen bevat
○ Meetstaal wordt verneveld en vermengd met plasma
○ Mengsel wordt door een elektrische spoel gestuurd waardoor een wisselstroom loopt
§ Wisslend magneetveld door de wisselstroom
§ Magneetveld doet de geladen deeltjes in rondjes bewegen dmv Lorentskracht
§ Niet geladen deeltjes draaien niet --> botsing met draaiende geladen deeltjes--> temp stijgt sterk
○ Erg hoge stabiele temperaturen: 6000-10000°C
§ Atomisatie en excitatie --> meer volledig dan bij vlam
Moleculaire Een molecule heeft meerdere mogelijke energietoestanden - Hg lamp - Geschikte goflengte selecteren met primaire monochromator/filter De fluorescentie wordt maar in 1 riuchting gemeten --> zwakke intensiteit --> fotovermenigvuldigingsbuis gebruiken met blanco Fluorimetrie is zeer gevoellig
emissie Elk E niv heeft meerdere V toestanden (en R) • Gasontladingslamp met hoge lichtintensiteit - 90° op meetstaal om srooilicht van de lichtbron te vermijden
spectrofotome --> de E niveaus zijn enkel bereikbaar door absorptie van UV of ZL (door een foton met het juiste energie niveau • Hierdoor zal de fluorescentieintensiteit ook hoger zijn - Bepaling van kinine, thiamine en riboflavine
trie/ - Strooilicht afkoomstig van de lichtbron en fluorescentieverschijnselen afk van
Fluorimetrie Energie verliezen kan op 2 manieren: andere componenten elimineren door gebruikl te maken van een secundaire
- Stralingsloze relaxatie: een uitsttaling van EMS -->energie verlies ovv warmte golflengteselector tussen stof en detector
○ Vibrationele relaxatie: doorgave van vibratie energie naar lagere vibratie niveaus (oplossing zal een klein beetje verwarmen) • Is dit een monochromator: spectrofotometrie
○ Interne conversie: overgang in E niveaudoor bv overgang van lage V van E2 naar overlappende hoge V niveaus van E1
○ Telkens mogelijk door botsingen met solvent moleculen (externe conversie)
- Fluorescentie: energieverlies ovv licht
○ Heel snel
○ Vaak voorafgegaan door een of meer vormen van stralingsloze desactivatie
§ Ea>Ef
Ø Wanneer een fluorimeter wordt ingezet voor kwantitatieve analyses is de gemeten fluorescentie enkel recht evenredig voor zijn conc
voor zeer kleine conc (bij hoge conc afbuiging van de ijklijn door zelfabsorptie
Polarimetrie Een optisch actieve stof kan de polarisatierichting van licht veranderen onder een hoek ɑ, een polarimeter meet deze hoek Vaak wordt een Na lamp gebruikt (geel licht) --> D-lijn Analysator gewone polarimeter POLARIMETERBUIS Kwantitatieve bepaling van suikers
Kwantitatief kan deze optisch actieve stof worden bepaald aan de hand van het opstellen van een ijklijn met ijkoplossingen en dan te interpoleren Golflengte van 589 nm = polaroidfilm of nicol prisma (polarisator)--> laat toe hoek alpha te meten - Afgesloten transparante buis met nauwkeurig gekende lengte
--> de ijklijn is lineair omwille van de wet van Biot - Mag geen luchtbellen bevatten--> verstrooiing
Buis gevuld met water:
Kwalitatief kan men een onbekende optisch actieve stof met gekende conc bepalen door eerst het specifieke optische draaivermogen [ɑ] te bepalen - Als doorlaatrichting van de polarisator en de analysator loodrecht op elkaar staan: geen licht wordt doorgelaten want water is POLARISATOR
- Eerst draaihoek meten van analiet optisch niet actief Meetstaal moet worden belicht door lineair gepolariseerd licht (Na lamp zendt mono chromatisch licht uit= ongepolariseerd)
- Na berekening in literatuur opzoeken over welke stof het gaat Buis gevuld met staal (staal tussen polarisator en analysator) Polarisator zet ongepolariseerd licht om in lineair gepolariseerd licht
- Deel van het licht zal worden afgebogen --> deel van licht zal worden doorgelaten - Polaroid film
- Analysator draaien tot het weer volledig donker is --> analysator is gedraaid over hoek alpha ○ Kunststof samengesteld uit lange smalle moleculen die allemaal in dezelfde richting zijn opgelijnd
○ "volledig donker" = nauwelijks waarneembaar voor het menselijk oog --> oplossen door een halfschaduwpolarimeter te ○ Als het elektrische veld van een lichtstraal dezelfde richting heeft als de lengterichting van de moleculen--> trillend elektrisch
gebruiken! veld kan e- op en neer laten bewegen in de polaroid film, langs de lange, smalle moleculen
○ De e- die mee trillen absorberen de energie van de lichtstraal --> lichtstraal geraakt niet doorheen de film
HALFSCHADUWPOLARIMETER ○ ENKEL als het elektrische veld van de lichtstraal LOODRECHT op de lengterichting staat, zal de polarisatirichting worden
doorgelaten (want kan geen e- laten bewegen, dus de energie wordt niet geabsorbeerd)
- Nicol prisma
○ Bestaat uit twee stukken calciet (= dubbelbrekend materiaal--> heeft een andere brekingsindex voor vertikaal en horizontaal
- gepolariseerd licht) met daartussen canadabalsem
§ Er kan maar 1 polarisatirichting door de canadabalsem ( de andere lchtstraal heeft een invalshoek groter dan de
grenshoek
§ Canadabalsem is net iets ijler dan de calciet (dicht)
- Extra klein Nicolprisma aan de bovenzijde op een constante hoek (vb 45°) verdraaidtov polarisator
- Er ontstaan zo twee gepolariseerde lichtbundels, waarvan 1 op 45° verdraaid is
-
- Bundels worden samen door de polarimeterbuis gestuurd
- De bundels hebben niet meer dezelfde lichtintensiteit doordat ze (1 of 2x) gebroken zijn door het nicolprisma
○ Elke keer dat licht door een Nicolprisma gaat, vermindert de intensiteit met 50%
○
○ Op de analysator komt alpha = 0° overeen met als water in de buis zou zitten (is optisch niet actief, geen afbuiging)
○ Een optisch actieve stof zal de polarisatierichting van R en Q veranderen
○ Alpha kan worden bepaald door de analysator te draaien naar het punt dezelfde licht beschaduwde velden vertonen
Immunochemis Principe Soort werking
che technieken Kleine conc antillichamen/ antigenen bepalen --> geen zichtbare neerslag FIA: fluorescentie immuno-assay soort werking Detectie
- Antilichamen of antigenen merken met
○ Radio-actieve component direct - Fluorochroom direct aan het antillichaam gebonden - Bekijken onder microscoop
○ Fluorochroom - Na binding aan antigen= excitatie - Uitgezonden I meten met fluorimeter
○ Enzymen indirect - Ongelabeld antilichaam bindt aan antigen - Microscoop
- Tweede met fluorochroom gelabelde antilichaam bindt aan eerste antilichaam (vormt antigen-antilichaam complex) - I meten met fluorimeter
EIA: enzym immuno-assay = zeer gevoellig en specifiek
- Enzym covalent gebonden aan antillichaam
- Enzym zet substraat van een reactiemengsel omzetten tot reactieproduct
- Spectrofotometrische analyse
Belangrijkste techniek: ELISA
ELISA enzyme linked immunosrobent assay - Peroxidase uit mierikswortel (horseradisch peroxidase) of alkalisch fosfatase gebruiken
- 1 immunoreagens geadsorbeerd aan een vaste drager (= coating) --> verliest hierdoor geen activiteit
- Tweede reagens = gemerkt meet een enzym
- Hoeveelheid gevormde immuuncomplex gedurende bepaalde tijd = maat voor hoeveelheid antigen/ antilichamen aanwezig
- Belangrijkste immunochemische techniek in de vwa
• Allergenen, bepaling soorten bacteriën, screening (myco)toxinees,…
soort werking
direct - Antigen aan vaste drager (micrititerplaat) geadsorbeerd (= coating)
- Overmaat gemerkt, specifiek, primair antilichaam
- Na incubatie wordt overmaat weg gewassen
indirect - Abtigen geadsorbeerd aan de vaste drager
- Primiar antilichaam bindt op antigen (ongemerkt)
- Gemerkt secundair antilichaam gebruiken voor visualisatie (= specifiek voor primair antilichaam)
- Na toevoeging van gepast substraat kan enzym worden gevisualiseerd
sandwich - Antilichaam gefixeerd aan de vaste drager
- Antigene worden toegevoegd
- Na incuberen wordt overmaat gemerkte antilichamen toegevoegd
- Overmaat niet gebonden antilichamen worden verwijderd
- Hoe meer antigenen aan de eerste antilichamen gebonden waren, hoe meer enzymgebonden antilichamen hebben kunnen binden
- Kleur is evenredig met de hoeveelheid antilichamen in het staal
competitie =CELIA
Kan direct en indirect
- Op microtiterplaat worden aan de binnenkant antilichamen aangebracht
- Staal (met ongekend aantal antigenen) wordt gemengd met een gekende hoeveelheid van hetzelfde antigen, maar dan gemerkt met een enzym
• Het antigen is hierbij dus totaal in overmaat
- Beide vormen van het antigen zullen in competitie gaan voor de antilichamen op de microtiterplaat
- Na incubatie worden de niet gebonden antigenen weggewassen
- Substraat wordt toegevoegd
- De kleur intensiteit is evenredig met de hoeveelheid gebonden enzym en dus omgekeerd evenredig met de concentratie van antigenen in het staal
zaterdag 30 mei 2026 05:29
Analyse Werkingsmechanisme Lichtbron Golflengteselector Staalvorm: blanco/analiet Detector Extra onderdelen Toepassingen
techniek
Refractometer Adhv de breking van licht (volgenss wet van snellius) de grenshoek bepalen. Door totale weerkaatsing zal de grenshoek zichtbaar zijn in het oculair Monochromatisch ligt gebruiken aangezien de brekingsinde Oculair: scheiding tussen licht en donker aflezen - Kwantitatieve analyses van eenvoudige/enkelvoudige oplossingen
(van Abbé) - Druppel monster uitgesmeerd tussen 2 prismas afhankelijk is van de kleur van het licht een schaalverdeling geeft de n weer - Kwaliteitscontrole
- Prisma is optisch dichter dan het staal --> breking naar N toe - Verlichtend prisma - Opvolging rijpingsproces fruit
○ Grenshoek is dus altijd kleiner dan de invalshoek • Verlicht door externe lichtbroen (vb gloeilamp) - Urine onderzoek, bloed analyses,…
- Kijken naar hoe breking van licht gebeurt op punt A • Heeft ruw onderste oppervlak zodat het staal uit alle
- Kijker verdraaien tov prisma tot scheiding tussen licht en donker zichtbaar is mogelijke richtingen belicht wordt
○ Scheiding is wazig kleurenspectrum (want grenshoek en brekingsindex zijn kleurafhankelijk) als met wit licht wordt gewerkt
§ Oplossen door "compenserende prismas" te gebruiken
-
- Licht laten invallen langs onderste prisma
- men kan ook zonder verlichtend prisma werken!
- N is T afhankelijk (n daalt als T stijgt) meestal bij 20-25°C
Brekingsindexen worden vaan weergegeven in %Brix (vb 20%Brix= zelfde n als een oplossing met 20g sucrose en 80g water)
• Minder scherp contrast omdat de het doorgelaten licht ook
deels wordt weerkaatst
Moleculaire Elke stof absorbeert EM straling met specifieke frequenties (afspiegeling van de orbitaalstructuur van een molecule--> vingerafdruk van een stof) Continue lichtbronnen: zenden veel golflengten uit - Filter - Rechthoekig buisje met lengte x waarin A of B zit Gemeten stralingsenergie wordt omgezet in een elektrisch signaal Bij dubbelstraal: - Conc berekenen door een ijklijn met ijkoplossingen op te stellen volgens de wet
absoprtie --> identificatie mogelijk door een absorptiespectrum op te stellen --> meestal Obv verhitten van eend raagd tot roodgloeihtte waardoor • Gekleurd glas: absorptiefilter - De cuvet zal de I0 verminderen (cuvet met oplosmiddel absorbeert - Roterende spiegel van Lambert-Beer en dan de A onbekende hier op te interpoleren
spectrofotome deze EMS uitzend - Monochromator ook een deen van het licht) - Fotovoltaïsche cel (= grenslaagcel of fotocel) - Beam splitter - Gebruik van kleurreacties voor de bepaling van fosfor/melkzuur/beta-
trie - Gloeilamp/ wolfraamlamp • Reflectierooster - Licht kan ook weerkaatsen of via diffusie verloren gaan ○ Eenvoudig caroteen/vit C in levensmiddelen
Volgens de wet van Lambert-Beer is er een lineair verband tussen concentratie en absorptie: A= ɛ*c*x ○ ZL en nabije IR (350-2500nm) • Transmissierooster --> oplossen door gebruik te maken van een BLANCI ○ Platte elektrode uit Fe of Cu met een dunne laag halfgeleider (Se of Cu2O) die weer bedekt is met een dun laagje Bij IR - Bestanddelen aantonen door specifieke werking van een enzym
--> door een ijklijn op te stellen met ijkoplossingen kan een onbekende concentratie worden bepaald adhv de absorptie en interpolatie in deze ijklijn - Waterstoflamp/deuteriumlamp • Prisma = zelfde cuvet, met zelfde oplosmiddel en dezelfde reagentia (transparant) sterk geleidend materiaal (Au, Ag, Pb)= collectorelektrode - IR lamp • Veel enzymes katalyseren rea enkel als NADH en/of ATP aanwezig zijn
- Bij het opstellen van de ijklijn werken met golflengte met max absorptie aangezien de stof andere golflengten niet absorbeert ○ Cilindrische kwartsbuis(UV) met deuterium of waterstof ○ Als EMS op Se invalt--> e- vrij--> worden opgevangen door dunne laagje metaal op Se ○ NADH en NAD+ hebben andere absorptiespectra --> evenredig met
bij lage druk Probleem: monochromators kunnen meestal niet exact 1 golflengte uitzenden, ○ Er ontstaat een spanning tss metaal en drager elektrode--> elektrische stroom --> meten comp (bv glucose)
○ Door een aangelegde spanning worden de gasmoleculen wel een beperkt golflengtegebied = bandenspectrum - Standaart worden glazen/ plastieken cuvetten gebruikt § Minder gevoelig--> vermoeid, kan niet met monochromator worden gebruikt want I is te klein
geëxiteerd--> zenden bij terugval licht uit - Bandreedte moet smaller zijn dan de absorptiepiek om het lineaire verband - Voor metingen in UV licht ( 350nm>) kwarts cuvetten gebruiken § Goedkoop en stevig
○ 160-380 nm goed te kunnen weergeven
- Kwiklampen • Alle uitgezonden golflengten zullen dan worden opgenomen, er is geen
○ Zelfde werking als waterstof/deuteriumlamp maar zendt storend licht
enkel lijnenspectrum van kwikdamp uit - Als de bandbreedte wel breder is dan de absorptiepiek, is er last van storing
§ Niet geschikt voor absorptiemetingen
§ Wel bruikbaar bij kwantitatieve abs metingen met -
vaste golflengten van een vd kwiklijnen
• Hierdoor zal de wet van Lambert-Beer gaan afwijken bij een hogere
concentratie
○ Enkel bij hogere conc aangezien de I bij lage conc nog vrij hoog zal
Lijnbronnen: zenden maar een beperkt aantal golflengtes
zijn end e invloed van Is minimaal is, hoe hoger de concentratie, hoe
kleiner de I, dus hoe meer invloed Is zal hebben - Fotobuis (= foto-elektrische cel of vacuüm cel)
○ Luchtledige glazen buis (ev met kwartsvenster)
○ Kathode in de vomr van een halfcilinder bedekt met een alkalymetaal of metaaloxide --> e- kunenn worden vrijgesteld
als EMS kathode bereikt
○ Staarformige anode
•
○ Over anode en kathode loopt spanning: als e- worden vrijgesteld uit kathode --> aangetrokken door anode
soort werking Uitleg ○ Er ontstaat een zwakke elektrische stroom evenredig met de ingevallen lichtintensiteit
spectroscoop - Polychromatisch licht bundelen met lens
- Licht valt in op twee prisma's --> breking
- Volledig kleurenspectrum zichtbaar
- Een gekleure opl zal bepaalde golflengten absorberen --> donkere banden
Geeft de absorptielijnen weer
enkelstraal 1 lichtbundel aanwezig
Als golflengteselector = filter = colorimeter
Nadeel: door tijd die verloopt tussen analyse blanco en analiet kunnen fluctuaties in lichtintensiateit optreden - Fotovermenigvuldigingsbuis = uitbreiding van de fotobuis
○ Tussen kathode en anode zitten meerdere elektroden (genaamd dynoden) die progressief op een hogere potentiaal
--> opgelost door gebruik te maken van een dubbelstraal spectrofotometer worden gehouden
○ Als EMS e- vrijmaakt uit de kathode bedekt met alkalimetaal --> aangetrokken door de secundaire dynode
○ Door de snelheid waarmee de elektronen aankomen, worden er meer elektronen vrijgesteld
○ Deze worden weer aangetrokken door de volgende dynode op een iets hogere potentiaa
○ Dit process herhaalt zich tot de oorspronkelijke kathodestroom 10^6 x versterkt is
○ Deze stroom wordt gemeten en om
○
○ gezet tot een elektrisch signaal
§ Grote gevoeligheid
dubbelstraal Splitsing van lichtstraal waardoor analiet en blanco tegelijk kunnen worden gemeten
- Roterende spiegel
- Beamsplitter (V-vormige spiegel) ○
○ Bij deze optie moet men gebruik maken van 2 detectoren
infrarood - Gebruikt een IR lamp
- Organische, anorganische en biologische bindingen identificeren
Fotonen uit IR geboed (2,5-15μm) hebben de geschikte energie om trillingen die atomen uitvoeren rond hun evenwichtspositie te
veranderen
--> bekomen absorptiespectra vertonen zo absorptiebanden die overeenkomen met specifieke functies
Atomaire Atomen absorberen bepaalde golflengte van EMS--> met wet van Lambert-Beer kan men kwantificeren Holle kathodelamp - Meestal rooster: voornaamste lijn van het emissiespectrum van de holle - Fotovermenigvuldigingsbuis omdat signaalverschil tussen analiet en blanco heel klein is ATOMISATOR Dosering van:
absorptie - Glazen omhulling met kwartsvenster kathodelamp afzonderen - Vlam - Ca
spectrofotome - Ar gas onder lage druk ○ Monster opzuigen door perslucht - Mg
trie - Anode= wofraamdraadje dat door glaswand steekt ○ Verstuiven als fijne nevel in verstuiver - Fe
- Kathode: hol en gemaakt uit het te bepalen element (vb Na) ○ In de vlam verdampt het SOLVENT= desolventatie - Zn
- Er wordt een spanning aangelegd --> ar wordt geïoniseerd --> ○ Vaste monsterdeeltjes ontstaan - Cu
bombarderen kathode ○ Door hoge T worden de metaal ionen omgezet in metaal atomen - Mn
- Doordat de kathode wordt gebombardeerd worden - Grafietoven - Na
metaalatomen losgerukt, sommige zijn geëxciteerd ○ Enkele μl in een laatje op de oven - K
- Geëxiteerde metaal atomen vallen terug naar gronddtoestand ○ Solvent wordt verdampt
en zenden zo lijnenspectrum van het te bepalen element uit • T heel snel opgedreven waardoor de achtergebleven vaste stof heel snel atomiseert in de gasfase
Er kunnen veel lijnen worden uitgezonden, zeker als kathode bedekt CHOPPER
is met een legering --> monochromator nodig Onderscheid maken tussen straling afkomstig van de holle kathodelamp en straling afkomstig van de vlam
- Groot deel van licht van de vlam wordt geëlimineerd door monochromator
- Sommige atomen raken in de vlam geëxciteerd door de hoge hitte: zullen ook straling uitzenden!
- Als het lichtsignaal van de holle kathodelamp wordt gemoduleerd, kunnen deze problemen worden verholpen
- R
-
- oterende sectorschijf--> geeft in de detector een wisselstroom ipv gelijkstroom
'
Atomaire Analyse van elementen obv hun uitgezonden lijnen spectrum door lichtemissie Vlam = lichtbron en atomisator/excitator! Resonantielijn van het te analyseren element selecteren en andere golflengten Hoge conc: fotocel ATOMISATOR Bepaling van alkali en aardalkalimetalen
emissie - Atomen worden geëxciteerd door aanvoer van energie (uitgezonden door andere elementen) tegenhouden - Vlam Vb:
spectrofotome - Bij terugkeer naar hun gronddtoestand zenden ze energie uit Lage conc: vacuümfotocel of fotovermenigvuldigingsbuis ○ Staal door perslucht meegezogen naar de mengkamer - Na en K in planten en fruit
trie / - Elk atoom zend een specifiek lijnen spectrum uit (karakteristiek lijnenspectrum in ZL en UV) Filter of monochromator ○ Staal wordt vertsoven tot een fijne nevel/spray --> met perslucht meegzeogen naar de vlam
Vlamfotometri Opletten bij hoge conc: kans op zelfabsorptie ○ Druppels slaan neer op wanden van de mengkamer --> worden gedraineerd
e - Straling die door atomen uit A worden uitgezonden, worden opgenomen door andere atomen uit het analiet, waardoor de gemeten emissie intensiteit verzwakt ○ Saal onderweg naar vlam vermengen met brandgas (vb acetyleen of propaan)
- De ijklijn zal hierdoor afbuigen bij hoge concentraties ○ Vlam atomatiseert het staal en levert de energie om de atomen te exciteren
○ T tussen 1000-3000°C
○ Enkel KWANTITATIEVE analyses (vlamfotometrie)
- Heet plasma= ICP= inductief gekoppelde plasma ontlading
○ Plasma= geleidend gas
§ = gas dat naast atomen en moleculen ook een substantiële fractie aan ionen en elektronen bevat
○ Meetstaal wordt verneveld en vermengd met plasma
○ Mengsel wordt door een elektrische spoel gestuurd waardoor een wisselstroom loopt
§ Wisslend magneetveld door de wisselstroom
§ Magneetveld doet de geladen deeltjes in rondjes bewegen dmv Lorentskracht
§ Niet geladen deeltjes draaien niet --> botsing met draaiende geladen deeltjes--> temp stijgt sterk
○ Erg hoge stabiele temperaturen: 6000-10000°C
§ Atomisatie en excitatie --> meer volledig dan bij vlam
Moleculaire Een molecule heeft meerdere mogelijke energietoestanden - Hg lamp - Geschikte goflengte selecteren met primaire monochromator/filter De fluorescentie wordt maar in 1 riuchting gemeten --> zwakke intensiteit --> fotovermenigvuldigingsbuis gebruiken met blanco Fluorimetrie is zeer gevoellig
emissie Elk E niv heeft meerdere V toestanden (en R) • Gasontladingslamp met hoge lichtintensiteit - 90° op meetstaal om srooilicht van de lichtbron te vermijden
spectrofotome --> de E niveaus zijn enkel bereikbaar door absorptie van UV of ZL (door een foton met het juiste energie niveau • Hierdoor zal de fluorescentieintensiteit ook hoger zijn - Bepaling van kinine, thiamine en riboflavine
trie/ - Strooilicht afkoomstig van de lichtbron en fluorescentieverschijnselen afk van
Fluorimetrie Energie verliezen kan op 2 manieren: andere componenten elimineren door gebruikl te maken van een secundaire
- Stralingsloze relaxatie: een uitsttaling van EMS -->energie verlies ovv warmte golflengteselector tussen stof en detector
○ Vibrationele relaxatie: doorgave van vibratie energie naar lagere vibratie niveaus (oplossing zal een klein beetje verwarmen) • Is dit een monochromator: spectrofotometrie
○ Interne conversie: overgang in E niveaudoor bv overgang van lage V van E2 naar overlappende hoge V niveaus van E1
○ Telkens mogelijk door botsingen met solvent moleculen (externe conversie)
- Fluorescentie: energieverlies ovv licht
○ Heel snel
○ Vaak voorafgegaan door een of meer vormen van stralingsloze desactivatie
§ Ea>Ef
Ø Wanneer een fluorimeter wordt ingezet voor kwantitatieve analyses is de gemeten fluorescentie enkel recht evenredig voor zijn conc
voor zeer kleine conc (bij hoge conc afbuiging van de ijklijn door zelfabsorptie
Polarimetrie Een optisch actieve stof kan de polarisatierichting van licht veranderen onder een hoek ɑ, een polarimeter meet deze hoek Vaak wordt een Na lamp gebruikt (geel licht) --> D-lijn Analysator gewone polarimeter POLARIMETERBUIS Kwantitatieve bepaling van suikers
Kwantitatief kan deze optisch actieve stof worden bepaald aan de hand van het opstellen van een ijklijn met ijkoplossingen en dan te interpoleren Golflengte van 589 nm = polaroidfilm of nicol prisma (polarisator)--> laat toe hoek alpha te meten - Afgesloten transparante buis met nauwkeurig gekende lengte
--> de ijklijn is lineair omwille van de wet van Biot - Mag geen luchtbellen bevatten--> verstrooiing
Buis gevuld met water:
Kwalitatief kan men een onbekende optisch actieve stof met gekende conc bepalen door eerst het specifieke optische draaivermogen [ɑ] te bepalen - Als doorlaatrichting van de polarisator en de analysator loodrecht op elkaar staan: geen licht wordt doorgelaten want water is POLARISATOR
- Eerst draaihoek meten van analiet optisch niet actief Meetstaal moet worden belicht door lineair gepolariseerd licht (Na lamp zendt mono chromatisch licht uit= ongepolariseerd)
- Na berekening in literatuur opzoeken over welke stof het gaat Buis gevuld met staal (staal tussen polarisator en analysator) Polarisator zet ongepolariseerd licht om in lineair gepolariseerd licht
- Deel van het licht zal worden afgebogen --> deel van licht zal worden doorgelaten - Polaroid film
- Analysator draaien tot het weer volledig donker is --> analysator is gedraaid over hoek alpha ○ Kunststof samengesteld uit lange smalle moleculen die allemaal in dezelfde richting zijn opgelijnd
○ "volledig donker" = nauwelijks waarneembaar voor het menselijk oog --> oplossen door een halfschaduwpolarimeter te ○ Als het elektrische veld van een lichtstraal dezelfde richting heeft als de lengterichting van de moleculen--> trillend elektrisch
gebruiken! veld kan e- op en neer laten bewegen in de polaroid film, langs de lange, smalle moleculen
○ De e- die mee trillen absorberen de energie van de lichtstraal --> lichtstraal geraakt niet doorheen de film
HALFSCHADUWPOLARIMETER ○ ENKEL als het elektrische veld van de lichtstraal LOODRECHT op de lengterichting staat, zal de polarisatirichting worden
doorgelaten (want kan geen e- laten bewegen, dus de energie wordt niet geabsorbeerd)
- Nicol prisma
○ Bestaat uit twee stukken calciet (= dubbelbrekend materiaal--> heeft een andere brekingsindex voor vertikaal en horizontaal
- gepolariseerd licht) met daartussen canadabalsem
§ Er kan maar 1 polarisatirichting door de canadabalsem ( de andere lchtstraal heeft een invalshoek groter dan de
grenshoek
§ Canadabalsem is net iets ijler dan de calciet (dicht)
- Extra klein Nicolprisma aan de bovenzijde op een constante hoek (vb 45°) verdraaidtov polarisator
- Er ontstaan zo twee gepolariseerde lichtbundels, waarvan 1 op 45° verdraaid is
-
- Bundels worden samen door de polarimeterbuis gestuurd
- De bundels hebben niet meer dezelfde lichtintensiteit doordat ze (1 of 2x) gebroken zijn door het nicolprisma
○ Elke keer dat licht door een Nicolprisma gaat, vermindert de intensiteit met 50%
○
○ Op de analysator komt alpha = 0° overeen met als water in de buis zou zitten (is optisch niet actief, geen afbuiging)
○ Een optisch actieve stof zal de polarisatierichting van R en Q veranderen
○ Alpha kan worden bepaald door de analysator te draaien naar het punt dezelfde licht beschaduwde velden vertonen
Immunochemis Principe Soort werking
che technieken Kleine conc antillichamen/ antigenen bepalen --> geen zichtbare neerslag FIA: fluorescentie immuno-assay soort werking Detectie
- Antilichamen of antigenen merken met
○ Radio-actieve component direct - Fluorochroom direct aan het antillichaam gebonden - Bekijken onder microscoop
○ Fluorochroom - Na binding aan antigen= excitatie - Uitgezonden I meten met fluorimeter
○ Enzymen indirect - Ongelabeld antilichaam bindt aan antigen - Microscoop
- Tweede met fluorochroom gelabelde antilichaam bindt aan eerste antilichaam (vormt antigen-antilichaam complex) - I meten met fluorimeter
EIA: enzym immuno-assay = zeer gevoellig en specifiek
- Enzym covalent gebonden aan antillichaam
- Enzym zet substraat van een reactiemengsel omzetten tot reactieproduct
- Spectrofotometrische analyse
Belangrijkste techniek: ELISA
ELISA enzyme linked immunosrobent assay - Peroxidase uit mierikswortel (horseradisch peroxidase) of alkalisch fosfatase gebruiken
- 1 immunoreagens geadsorbeerd aan een vaste drager (= coating) --> verliest hierdoor geen activiteit
- Tweede reagens = gemerkt meet een enzym
- Hoeveelheid gevormde immuuncomplex gedurende bepaalde tijd = maat voor hoeveelheid antigen/ antilichamen aanwezig
- Belangrijkste immunochemische techniek in de vwa
• Allergenen, bepaling soorten bacteriën, screening (myco)toxinees,…
soort werking
direct - Antigen aan vaste drager (micrititerplaat) geadsorbeerd (= coating)
- Overmaat gemerkt, specifiek, primair antilichaam
- Na incubatie wordt overmaat weg gewassen
indirect - Abtigen geadsorbeerd aan de vaste drager
- Primiar antilichaam bindt op antigen (ongemerkt)
- Gemerkt secundair antilichaam gebruiken voor visualisatie (= specifiek voor primair antilichaam)
- Na toevoeging van gepast substraat kan enzym worden gevisualiseerd
sandwich - Antilichaam gefixeerd aan de vaste drager
- Antigene worden toegevoegd
- Na incuberen wordt overmaat gemerkte antilichamen toegevoegd
- Overmaat niet gebonden antilichamen worden verwijderd
- Hoe meer antigenen aan de eerste antilichamen gebonden waren, hoe meer enzymgebonden antilichamen hebben kunnen binden
- Kleur is evenredig met de hoeveelheid antilichamen in het staal
competitie =CELIA
Kan direct en indirect
- Op microtiterplaat worden aan de binnenkant antilichamen aangebracht
- Staal (met ongekend aantal antigenen) wordt gemengd met een gekende hoeveelheid van hetzelfde antigen, maar dan gemerkt met een enzym
• Het antigen is hierbij dus totaal in overmaat
- Beide vormen van het antigen zullen in competitie gaan voor de antilichamen op de microtiterplaat
- Na incubatie worden de niet gebonden antigenen weggewassen
- Substraat wordt toegevoegd
- De kleur intensiteit is evenredig met de hoeveelheid gebonden enzym en dus omgekeerd evenredig met de concentratie van antigenen in het staal
