GeneticaGenomica
H15: Toepassingen van recombinant DNA- technologie
1. DNA-polymorfismen
= plaats in genooom met twee of meer allelische varianten, die elk relatief frequent voorkomen (min. 1%)
➔ “min. 1%” sluit zeldzame mutaties uit (niet bruikbaar in genetische analyse)
➔ Meestal geen fenotypisch effect = in niet-coderende DNA sequentie
DNA-merkers:
• = polymorfismen waarvan men de exacte positie in het genoom kent
• Gebruikt voor het maken van kaarten (fysische en genetisch)
Types DNA-polymorfismen:
• SNPs: Single nucleotide polymorphisms
• STRs: Short tandem repeats = microsatellieten
• VNTRs: Variable number of tandem repeats= minisatellieten
1.1. SNP’s
Een SNP is een variatie in één enkele base (A, T, C of G) in het DNA
• SNP = single nucleotide polymorphism
• Er zijn twee varianten (allelen): het verschil zit in één base → base substitutie.
- Tussen twee strengen is er maar één base verschuillend
Knipplaatsen: RFLP
Sommige SNPs liggen precies in een herkenningsplaats van een restrictie-enzym (een “knipplaats”).
• Als een SNP de sequentie van zo’n knipplaats verandert → enzym kan wel of niet knippen.
• →veroorzaakt een RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphis
= verschil in lengte van DNA-fragmenten na knippen
De meeste SNP-veranderingen liggen echter niet in een knipplaats, daarom:
• Niet elke SNP kan met RFLP worden opgespoord.
• Veel SNPs worden vandaag gedetecteerd met een SNP-chip (high-throughput technologie).
1
,Voorbeeld:
• Een DNA-fragment met een herkenningsplaats (bijv. GGCC) voor een restrictie-enzym.
• Bij ene allel = sequentie intact → enzym knipt
• Bij andere allel = SNP heeft sequentie veranderd → enzym kan niet knippen
Gevolg:
• Het ene DNA-molecuul wordt in twee kortere fragmenten geknipt.
• Het andere blijft één langer fragment.
Na elektroforese op een gel:
• Geknipt DNA → meerdere kortere banden
• Niet-geknipt DNA → één langere band
Dit verschil in fragmentlengte = RFLP
Principe van RFLP:
• 2 allelen= In het ene allel zit wel een knipplaats, in het andere niet
• behandeling met restrictie-enzym → verschillende fragmenten.
• Deze fragmenten scheid je met gelelektroforese.
Onderaan zie je een gel met banden:
• Homozygoot met knipplaats → enkel korte fragmenten
• Homozygoot zonder knipplaats → enkel lang fragment
• Heterozygoot → beide patronen tegelijk
Door te kijken naar het bandenpatroon kan je bepalen welk(e) allel(en) iemand heeft op die SNP-locus
DNA-typering (ook DNA-profilering / genetische vingerafdruk genoemd) = techniek die wordt gebruikt om
individuen te identificeren en van elkaar te onderscheiden op basis van hun unieke genetische kenmerken
➔ Kan door de analyse van RFLP
2
, 1.1.1. Analyse van RFLP
1) Southern Blot
2) PCR
3) DNA-chips
Afbeeling = In het midden zie je het DNA-fragment met een mogelijke knipplaats (rood kruis = SNP die de
knipplaats kan vernietigen) en een probe (rood balkje) die specifiek bindt aan dat stukje DNA
Southern blot:
= de oudere, arbeidsintensieve methode.
1) Je start met genomisch DNA → wordt eerst met restrictie-enzymen geknipt
2) Fragmenten = gescheiden via gelelektroforese → Daarna overgebracht op een membraan
→ dat is de Southern blot
3) Op dat membraan voeg je een probe toe:
- gelabeld DNA-fragment dat complementair is aan de regio die je wil bestuderen
- de probe bindt alleen aan het fragment dat jouw SNP-regio bevat
4) Gelelektroferesen = enkel de banden waar de probe gebonden heeft gevisualiseerd
• Wel geknipt → twee kortere fragmenten → twee banden
• Niet geknipt → één lang fragment → één band
• Heterozygoot → combinatie van beide patronen
PCR:
= moderne, snellere methode.
1) met PCR → enkel het relevante DNA-fragment amplificeren
2) PCR-product = knippen met het restrictie-enzym
3) Je doet gelelektroforese → Interpretatie identiek aan die van Blot
3
H15: Toepassingen van recombinant DNA- technologie
1. DNA-polymorfismen
= plaats in genooom met twee of meer allelische varianten, die elk relatief frequent voorkomen (min. 1%)
➔ “min. 1%” sluit zeldzame mutaties uit (niet bruikbaar in genetische analyse)
➔ Meestal geen fenotypisch effect = in niet-coderende DNA sequentie
DNA-merkers:
• = polymorfismen waarvan men de exacte positie in het genoom kent
• Gebruikt voor het maken van kaarten (fysische en genetisch)
Types DNA-polymorfismen:
• SNPs: Single nucleotide polymorphisms
• STRs: Short tandem repeats = microsatellieten
• VNTRs: Variable number of tandem repeats= minisatellieten
1.1. SNP’s
Een SNP is een variatie in één enkele base (A, T, C of G) in het DNA
• SNP = single nucleotide polymorphism
• Er zijn twee varianten (allelen): het verschil zit in één base → base substitutie.
- Tussen twee strengen is er maar één base verschuillend
Knipplaatsen: RFLP
Sommige SNPs liggen precies in een herkenningsplaats van een restrictie-enzym (een “knipplaats”).
• Als een SNP de sequentie van zo’n knipplaats verandert → enzym kan wel of niet knippen.
• →veroorzaakt een RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphis
= verschil in lengte van DNA-fragmenten na knippen
De meeste SNP-veranderingen liggen echter niet in een knipplaats, daarom:
• Niet elke SNP kan met RFLP worden opgespoord.
• Veel SNPs worden vandaag gedetecteerd met een SNP-chip (high-throughput technologie).
1
,Voorbeeld:
• Een DNA-fragment met een herkenningsplaats (bijv. GGCC) voor een restrictie-enzym.
• Bij ene allel = sequentie intact → enzym knipt
• Bij andere allel = SNP heeft sequentie veranderd → enzym kan niet knippen
Gevolg:
• Het ene DNA-molecuul wordt in twee kortere fragmenten geknipt.
• Het andere blijft één langer fragment.
Na elektroforese op een gel:
• Geknipt DNA → meerdere kortere banden
• Niet-geknipt DNA → één langere band
Dit verschil in fragmentlengte = RFLP
Principe van RFLP:
• 2 allelen= In het ene allel zit wel een knipplaats, in het andere niet
• behandeling met restrictie-enzym → verschillende fragmenten.
• Deze fragmenten scheid je met gelelektroforese.
Onderaan zie je een gel met banden:
• Homozygoot met knipplaats → enkel korte fragmenten
• Homozygoot zonder knipplaats → enkel lang fragment
• Heterozygoot → beide patronen tegelijk
Door te kijken naar het bandenpatroon kan je bepalen welk(e) allel(en) iemand heeft op die SNP-locus
DNA-typering (ook DNA-profilering / genetische vingerafdruk genoemd) = techniek die wordt gebruikt om
individuen te identificeren en van elkaar te onderscheiden op basis van hun unieke genetische kenmerken
➔ Kan door de analyse van RFLP
2
, 1.1.1. Analyse van RFLP
1) Southern Blot
2) PCR
3) DNA-chips
Afbeeling = In het midden zie je het DNA-fragment met een mogelijke knipplaats (rood kruis = SNP die de
knipplaats kan vernietigen) en een probe (rood balkje) die specifiek bindt aan dat stukje DNA
Southern blot:
= de oudere, arbeidsintensieve methode.
1) Je start met genomisch DNA → wordt eerst met restrictie-enzymen geknipt
2) Fragmenten = gescheiden via gelelektroforese → Daarna overgebracht op een membraan
→ dat is de Southern blot
3) Op dat membraan voeg je een probe toe:
- gelabeld DNA-fragment dat complementair is aan de regio die je wil bestuderen
- de probe bindt alleen aan het fragment dat jouw SNP-regio bevat
4) Gelelektroferesen = enkel de banden waar de probe gebonden heeft gevisualiseerd
• Wel geknipt → twee kortere fragmenten → twee banden
• Niet geknipt → één lang fragment → één band
• Heterozygoot → combinatie van beide patronen
PCR:
= moderne, snellere methode.
1) met PCR → enkel het relevante DNA-fragment amplificeren
2) PCR-product = knippen met het restrictie-enzym
3) Je doet gelelektroforese → Interpretatie identiek aan die van Blot
3
