Les 1 : Prokaryoten: Chromosoom en plasmiden. Genetische
manipulaties
1. Wat is de gemiddelde grootte van eukaryote cellen, prokaryote cellen en virussen ?
Eukaryote cellen: 10-100 µm
Prokaryote cellen (geen celkern): 1-3 µm
Virussen: 50-100 nm
2. Teken de algemene organisatie van de wand van Gram-positieve en Gram-negatieve
bacteriën met de namen van de verschillende componenten.
Gram-positieve bacteriën: hebben een
plasmamembraan en een dikke peptidoglycaanlaag.
De dikke peptidoglycaanlaag maakt het mogelijk om
een paarse kleur te verkrijgen.
Dus de paarse kleur door kristalviolet blijft
behouden dankzij de dikke laag peptidoglycaan.
Gram-negatieve bacteriën: hebben een minder
dikke peptidoglycaanlaag en ze hebben 2
membranen (binnen- en buitenmembraan).
Door de minder dikke peptidoglycaanlaag wordt de
paarse kleur niet behouden en hebben dus een
rode kleur.
Dankzij hun buitenmembraan zijn gramnegatieve
bacteriën resistenter tegen veel antibiotica.
3. Waarom werd de bacterie Escherichia coli veel gebruikt voor genetische manipulatie?
Escherichia coli (2 µm): Meest gebruikt in genetic engineering.
Het is een gram-negatieve bacterie, de natuurlijke habitat is onze darm, ze zijn niet pathogeen
(uitzondering: EPEC en EHEC). Ze zijn heel goed gekarakteriseerd (we kennen deze bacteriën
heel goed; op genetisch-, fenotypisch- en biochemisch niveau). Er zijn veel moleculaire tools. Heel
snelle groei (1 deling elke 20 minuten). Het genoom is volledig gesequeneerd en er is een goeie
annotatie.
4. Wat is peptidoglycaan, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de bacteriële
wand?
Peptidoglycaan is een netwerk, gemaakt van N-
acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur dat gebonden zijn
met een peptideketen. Dit is een structurele component van de
bacteriële celwand: dit geeft de rigiditeit en ook de vorm.
Er is een β (1 → 4)-link tussen de 2 glycanen.
Er is een peptideketen (er zijn enzymen die dit knippen en zo
de celwand kapot maken).
1
,Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag die je kan kapotmaken met
specifieke enzymen. Hebben maar 1 plasmamembraan.
Gramnegatieve bacteriën hebben een binnenmembraan, een periplasmatische ruimte met een
kleine laag peptidoglycaan en een buitenmembraan. Verder hebben ze lipopolysacchariden (LPS)
die verankerd zijn aan het buitenmembraan.
Mycobacteriën vormen een derde groep en hebben een andere celwandorganisatie. Het is moeilijk
te zeggen of ze gramnegatief of grampositief zijn.
5. Wat is de lipopolysaccharide, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de
bacteriële wand?
Lipopolysaccharide (LPS) is een structuur gemaakt van:
O-antigen: oppervlakte blootgestelde moraliteit
Buitenkern
Binnenkern
Lipide A: gemaakt van 2 glucosamines, acyl-ketens en 1 fosfaat
per glucosamine (het is negatief geladen)
Het immuunsysteem van gast en individu kan heel gemakkelijk dit O-antigen
herkennen. Dit is de eerste structuur van een indringer of een vreemde bacterie dat
wordt herkend wanneer het bijvoorbeeld het menselijk lichaam binnenkomt.
Maar sommige bacteriën hebben een manier gevonden om aan het immuunsysteem
te ontsnappen door hun O-antigen te verliezen.
In LPS zijn er verschillende negatieve ladingen. Daarom zijn er kationen zoals
Mg2+ die het LPS van bacteriën stabiliseren.
Als we tijdens een experiment een membraan willen destabiliseren zonder de
bacterie te doden, kan dat door het toevoegen van EDTA (een kationzuiger/ een
chelator).
Bv. Met antibodies wil je de oppervlakte van het buitenmembraan bereiken, als je EDTA toevoegt
zal je meer kans hebben dat het antibody het buitenmembraan kan bereiken (door de destabilisatie
van LPS na EDTA te hebben toegevoegd).
2
,6. Wat is, met betrekking tot lipopolysaccharide, het mogelijke nadeel van het gebruik van
bacteriën voor de productie van proteïnen van medisch belang?
Als je een antigen produceert dat je zal
gebruiken als een vaccin in E. Coli.
! De LPS is een endotoxine !
Een nadeel van het gebruik van bacteriën voor
de productie van proteïnen voor mensen en
dieren is de aanwezigheid van LPS. Zelfs een
klein beetje kan een groot gevaar vormen (grote
immuunreactie tot gevolg).
Activering van cellen van het immuunsysteem in verschillende condities. Negatieve controle aan
de linkerzijde (geen LPS), positieve controle aan de rechterkant (LPS) en recombinante proteïnen
besmet met endotoxines in het midden (supplier 1).
7. Noem twee belangrijke verschillen tussen een bacterieel chromosoom en een
bacterieel plasmide.
Plasmiden (klein) en chromosomen (groot) zijn structuren die de genetische informatie versterken.
Een bacterieel chromosoom is een grote circulaire DNA-molecule dat in het cytoplasma van
bacteriën wordt gevonden. Het bevat genen die essentieel zijn voor het leven van de bacterie
evenals niet-essentiële genen.
Het chromosoom van multiresistente
Acinetobacter baumannii is 4 miljoen bp
groot terwijl de plasmiden veel kleiner zijn.
Verschillende GC-gehaltes kunnen aantonen
dat vreemd DNA werd opgenomen. Het
mechanisme voor DNAopname
(transformatie door natuurlijke competenties)
wordt later gezien. A. baumannii is hier heel
goed in.
De grootte van het DNA van bacteriën hangt af van hun
levensstijl. Bacteriën in samenleving met een gastheer
hebben veel synthetische roots verloren omdat ze moleculen
gebruiken die door de gastheercel worden geproduceerd. Ze
stoppen daarom geen energie meer in het synthetiseren
deze moleculen. Omgekeerd ondergaan extracellulaire
bacteriën meer externe spanningen en veranderingen in
nutriëntenconcentraties. Ze moeten voedingstoffen zelf
synthetiseren en hebben dus meer genen in hun
chromosomen.
3
, Vibrio cholera
Deze bacteriën hebben 2 chromosomen.
In beide gevallen zijn essentiële genen
aanwezig op beide chromosomen.
Een groot chromosoom en een klein
chromosoom. Het lijkt op een plasmide maar
dat is het niet want je hebt essentiële genen
dat aanwezig zijn. Het verlies van een van de
chromosomen leidt tot dood van de bacterie.
Als ze doodgaan door het verliezen, omdat het essentiële genen bevat: dan is dat de definitie van
een chromosoom te zijn en niet een plasmide.
Brucella abortus
Een plasmide is een DNA-molecule dat een
origine of replicatie heeft en het is niet
essentieel om te overleven onder
gedefinieerde groeiomstandigheden.
8. Kan een bacteriecel een paar plasmiden samen bevatten?
Ja dat kan.
9. Geef de definitie van een bacterieel chromosoom.
Een bacterieel chromosoom is een grote circulaire DNA-molecule dat in het cytoplasma van
bacteriën wordt gevonden. Het bevat genen die essentieel zijn voor het leven van de bacterie
evenals niet-essentiële genen.
10. Teken de algemene organisatie van een plasmide en noem de verschillende
componenten.
De organisatie van een algemeen plasmide (pBR322)
met restientiesistes tegen antibiotica, promotors voor
genexpressie, één origin of replication voor replicatie
en overdraging naar dochtercellen en verschillende
restrictiesites.
Multiple cloning site = DNA-regio in eenzelfde
plasmide dat meerdere, verschillende unieke
restrictiesites bevat (vergemakkelijkt het klonen van
een locatie)
11. Noem drie gevolgen van het hebben van de ene specifieke oorsprong van replicatie
boven de andere.
- Replicatie-origines definiëren incompatibiliteitsgroepen (IncP, IncQ,…)
- De oorsprong van replicatie bepaalt het hostbereik (PMB1: beperkt, RK2: groot)
- De oorsprong van replicatie (ori) bepaalt het aantal exemplaren per cel (=copy number)
4
manipulaties
1. Wat is de gemiddelde grootte van eukaryote cellen, prokaryote cellen en virussen ?
Eukaryote cellen: 10-100 µm
Prokaryote cellen (geen celkern): 1-3 µm
Virussen: 50-100 nm
2. Teken de algemene organisatie van de wand van Gram-positieve en Gram-negatieve
bacteriën met de namen van de verschillende componenten.
Gram-positieve bacteriën: hebben een
plasmamembraan en een dikke peptidoglycaanlaag.
De dikke peptidoglycaanlaag maakt het mogelijk om
een paarse kleur te verkrijgen.
Dus de paarse kleur door kristalviolet blijft
behouden dankzij de dikke laag peptidoglycaan.
Gram-negatieve bacteriën: hebben een minder
dikke peptidoglycaanlaag en ze hebben 2
membranen (binnen- en buitenmembraan).
Door de minder dikke peptidoglycaanlaag wordt de
paarse kleur niet behouden en hebben dus een
rode kleur.
Dankzij hun buitenmembraan zijn gramnegatieve
bacteriën resistenter tegen veel antibiotica.
3. Waarom werd de bacterie Escherichia coli veel gebruikt voor genetische manipulatie?
Escherichia coli (2 µm): Meest gebruikt in genetic engineering.
Het is een gram-negatieve bacterie, de natuurlijke habitat is onze darm, ze zijn niet pathogeen
(uitzondering: EPEC en EHEC). Ze zijn heel goed gekarakteriseerd (we kennen deze bacteriën
heel goed; op genetisch-, fenotypisch- en biochemisch niveau). Er zijn veel moleculaire tools. Heel
snelle groei (1 deling elke 20 minuten). Het genoom is volledig gesequeneerd en er is een goeie
annotatie.
4. Wat is peptidoglycaan, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de bacteriële
wand?
Peptidoglycaan is een netwerk, gemaakt van N-
acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur dat gebonden zijn
met een peptideketen. Dit is een structurele component van de
bacteriële celwand: dit geeft de rigiditeit en ook de vorm.
Er is een β (1 → 4)-link tussen de 2 glycanen.
Er is een peptideketen (er zijn enzymen die dit knippen en zo
de celwand kapot maken).
1
,Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag die je kan kapotmaken met
specifieke enzymen. Hebben maar 1 plasmamembraan.
Gramnegatieve bacteriën hebben een binnenmembraan, een periplasmatische ruimte met een
kleine laag peptidoglycaan en een buitenmembraan. Verder hebben ze lipopolysacchariden (LPS)
die verankerd zijn aan het buitenmembraan.
Mycobacteriën vormen een derde groep en hebben een andere celwandorganisatie. Het is moeilijk
te zeggen of ze gramnegatief of grampositief zijn.
5. Wat is de lipopolysaccharide, wat zijn zijn subeenheden en waar is het in de
bacteriële wand?
Lipopolysaccharide (LPS) is een structuur gemaakt van:
O-antigen: oppervlakte blootgestelde moraliteit
Buitenkern
Binnenkern
Lipide A: gemaakt van 2 glucosamines, acyl-ketens en 1 fosfaat
per glucosamine (het is negatief geladen)
Het immuunsysteem van gast en individu kan heel gemakkelijk dit O-antigen
herkennen. Dit is de eerste structuur van een indringer of een vreemde bacterie dat
wordt herkend wanneer het bijvoorbeeld het menselijk lichaam binnenkomt.
Maar sommige bacteriën hebben een manier gevonden om aan het immuunsysteem
te ontsnappen door hun O-antigen te verliezen.
In LPS zijn er verschillende negatieve ladingen. Daarom zijn er kationen zoals
Mg2+ die het LPS van bacteriën stabiliseren.
Als we tijdens een experiment een membraan willen destabiliseren zonder de
bacterie te doden, kan dat door het toevoegen van EDTA (een kationzuiger/ een
chelator).
Bv. Met antibodies wil je de oppervlakte van het buitenmembraan bereiken, als je EDTA toevoegt
zal je meer kans hebben dat het antibody het buitenmembraan kan bereiken (door de destabilisatie
van LPS na EDTA te hebben toegevoegd).
2
,6. Wat is, met betrekking tot lipopolysaccharide, het mogelijke nadeel van het gebruik van
bacteriën voor de productie van proteïnen van medisch belang?
Als je een antigen produceert dat je zal
gebruiken als een vaccin in E. Coli.
! De LPS is een endotoxine !
Een nadeel van het gebruik van bacteriën voor
de productie van proteïnen voor mensen en
dieren is de aanwezigheid van LPS. Zelfs een
klein beetje kan een groot gevaar vormen (grote
immuunreactie tot gevolg).
Activering van cellen van het immuunsysteem in verschillende condities. Negatieve controle aan
de linkerzijde (geen LPS), positieve controle aan de rechterkant (LPS) en recombinante proteïnen
besmet met endotoxines in het midden (supplier 1).
7. Noem twee belangrijke verschillen tussen een bacterieel chromosoom en een
bacterieel plasmide.
Plasmiden (klein) en chromosomen (groot) zijn structuren die de genetische informatie versterken.
Een bacterieel chromosoom is een grote circulaire DNA-molecule dat in het cytoplasma van
bacteriën wordt gevonden. Het bevat genen die essentieel zijn voor het leven van de bacterie
evenals niet-essentiële genen.
Het chromosoom van multiresistente
Acinetobacter baumannii is 4 miljoen bp
groot terwijl de plasmiden veel kleiner zijn.
Verschillende GC-gehaltes kunnen aantonen
dat vreemd DNA werd opgenomen. Het
mechanisme voor DNAopname
(transformatie door natuurlijke competenties)
wordt later gezien. A. baumannii is hier heel
goed in.
De grootte van het DNA van bacteriën hangt af van hun
levensstijl. Bacteriën in samenleving met een gastheer
hebben veel synthetische roots verloren omdat ze moleculen
gebruiken die door de gastheercel worden geproduceerd. Ze
stoppen daarom geen energie meer in het synthetiseren
deze moleculen. Omgekeerd ondergaan extracellulaire
bacteriën meer externe spanningen en veranderingen in
nutriëntenconcentraties. Ze moeten voedingstoffen zelf
synthetiseren en hebben dus meer genen in hun
chromosomen.
3
, Vibrio cholera
Deze bacteriën hebben 2 chromosomen.
In beide gevallen zijn essentiële genen
aanwezig op beide chromosomen.
Een groot chromosoom en een klein
chromosoom. Het lijkt op een plasmide maar
dat is het niet want je hebt essentiële genen
dat aanwezig zijn. Het verlies van een van de
chromosomen leidt tot dood van de bacterie.
Als ze doodgaan door het verliezen, omdat het essentiële genen bevat: dan is dat de definitie van
een chromosoom te zijn en niet een plasmide.
Brucella abortus
Een plasmide is een DNA-molecule dat een
origine of replicatie heeft en het is niet
essentieel om te overleven onder
gedefinieerde groeiomstandigheden.
8. Kan een bacteriecel een paar plasmiden samen bevatten?
Ja dat kan.
9. Geef de definitie van een bacterieel chromosoom.
Een bacterieel chromosoom is een grote circulaire DNA-molecule dat in het cytoplasma van
bacteriën wordt gevonden. Het bevat genen die essentieel zijn voor het leven van de bacterie
evenals niet-essentiële genen.
10. Teken de algemene organisatie van een plasmide en noem de verschillende
componenten.
De organisatie van een algemeen plasmide (pBR322)
met restientiesistes tegen antibiotica, promotors voor
genexpressie, één origin of replication voor replicatie
en overdraging naar dochtercellen en verschillende
restrictiesites.
Multiple cloning site = DNA-regio in eenzelfde
plasmide dat meerdere, verschillende unieke
restrictiesites bevat (vergemakkelijkt het klonen van
een locatie)
11. Noem drie gevolgen van het hebben van de ene specifieke oorsprong van replicatie
boven de andere.
- Replicatie-origines definiëren incompatibiliteitsgroepen (IncP, IncQ,…)
- De oorsprong van replicatie bepaalt het hostbereik (PMB1: beperkt, RK2: groot)
- De oorsprong van replicatie (ori) bepaalt het aantal exemplaren per cel (=copy number)
4
