Kloneren: meerdere kopieën van een bepaald gen maken.
IDH1 gen in plasmide plaatsen door middel van restrictie. Om dat te kunnen doen moeten we het
IDH1 gen vermeerderen en restrictie sites aan plakken met behulp van PCR. Als je restrictie sites aan
je gen hebt gemaakt kun je die knippen, dan heb je je gen dat precies in de plasmide geplakt kan
worden en vervolgens in een bacterie zetten die het kan vermeerderen.
PCR
wat heb je nodig voor een PCR reactie?
- DNA template, zit het gen in
- DNA polymerase, enzym dat je nodig hebt om de
nucleotide in de nieuwe streng in te bouwen.
- Primers, want polymerase heeft iets nodig om op vast
te zitten. Startpunt voor DNA polymerase.
- Buffer, pH niveau stabiel houden. DNA polymerase is
een enzym en die heeft een bepaalde pH nodig om te
werken.
- MgCl2, is een zout dat DNA polymerase nodig heeft
om zijn werk te doen.
- dNTP, losse nucleotides die de DNA polymerase in
gaat bouwen in de streng.
DNA template
- plasmide DNA
- genomisch DNA uit de cel
- cDNA (mRNA uit de cel geïsoleerd en vervolgens via reverse trans omgezet naar cDNA) coderende
delen van het gen. Alle intronen zijn eruit.
Hoeveelheid DNA template moet niet te hoog maar ook niet te laag zijn. Te hoog verstoord PCR
reactie.
DNA polymerase
Taq DNA polymerase: uit warme bron bacterie, heft geen proofreading.
pfu DNA polymerase: proofreading activiteit. Maakt minder fouten
,Primer design.
Eerst de kanten van het DNA bepalen.
loaction
,Conditions for a good primer
* 50-60% CG. Meer waterstofbruggen vormen. Binden goed aan het DNA.
* 3’eind moet aan het uiteinde een C of G hebben, omdat de binding dan steviger is en dan kan de
polymerase dit als startpunt gebruiken.
* het kan zijn dat als er sequenties in je primer zitten die complementair zijn aan elkaar, kan de
primer zich dubbelvouwen. Dan kunnen die complementaire nucleotiden aan elkaar binden en dan is
hij niet bruikbaar want dan zit de primer dubbel gevouwen in plaats van dat hij op het DNA kan gaan
binden. Dat dubbelvouwen noemen we een hairpin formation.
* wat we ook niet willen is dat sequenties in zitten die aan elkaar gaan zitten primer dimer
formation.
* afstand tussen de primers is 1 tot 2 kb, maar niet groter. Hangt wel af van het gen. (voor normale
PCR)
* Annealing temperatuur 55-65 graden Celsius. De temperatuur waarbij de primer goed en specifiek
op je DNA gaat vast zitten. Primers mogen niet te veel verschillen in de annealing temperatuur, niet
meer dan 5 graden celcius.
ATG is startcodon.
TGA is stopcodon.
Primers zijn tussen de 19-24 nucleotide
The PCR program
wat gebeurd er tijdens de stappen en waarom hebben we die nodig?
Denaturatie, annealing en elongatie
denatureren
annealing
elongatie
, Denatureren: DNA template uit elkaar smelten, zodat de primers kunnen binden.
Annealing: startpunt geven voor DNA polymerase om het DNA te verlengen.
Elongatie: verlengen van het DNA.
- deze stappen herhaal je een aantal keer.
Op welke temperatuur en waarom?
rond de 95 graden, maar het hangt af van de DNA polymerase die je gebruikt.
Primers annealing temperatuur: tussen de 55 en 65 graden afhankelijk van de primerset.
Elongatie temperatuur: 72 graden.
opslag tussen de 4 en 14 graden.
te hoge temperatuur?
DNA polymerase is een eiwit, dus deze kan niet tegen te hoge temperaturen en denatureert hij
zichzelf. Optimale temperaturen.
Annealing temperatuur: te laag? de primers binden niet op de juiste plek aan het DNA template.
De moleculen bewegen namelijk niet zo hard.
temperatuur te hoog? De moleculen bewegen te hard waardoor de primers los laten.
elongatie/extension: hoge temperatuur zodat de polymerase er af gaat.
Wat gebeurd er als de annealing temperatuur tijdens PCR te laag is gezet voor de primers?
Dan krijg je a-specifieke binding en als je pech hebt een a-specifiek product
En een te hoge annealing temperatuur?
De moleculen bewegen teveel dat de primers losraken. Ze kunnen niet binden. je krijgt geen PCR
product
Wat gebeurd er als de annealing temperatuur tijdens de PCR alleen maar goed is voor één primer?
De andere primer komt op de verkeerde plek te zitten, a-specifieke binding.
Plasmide in DNA
cloning vector
IDH1 gen in plasmide plaatsen door middel van restrictie. Om dat te kunnen doen moeten we het
IDH1 gen vermeerderen en restrictie sites aan plakken met behulp van PCR. Als je restrictie sites aan
je gen hebt gemaakt kun je die knippen, dan heb je je gen dat precies in de plasmide geplakt kan
worden en vervolgens in een bacterie zetten die het kan vermeerderen.
PCR
wat heb je nodig voor een PCR reactie?
- DNA template, zit het gen in
- DNA polymerase, enzym dat je nodig hebt om de
nucleotide in de nieuwe streng in te bouwen.
- Primers, want polymerase heeft iets nodig om op vast
te zitten. Startpunt voor DNA polymerase.
- Buffer, pH niveau stabiel houden. DNA polymerase is
een enzym en die heeft een bepaalde pH nodig om te
werken.
- MgCl2, is een zout dat DNA polymerase nodig heeft
om zijn werk te doen.
- dNTP, losse nucleotides die de DNA polymerase in
gaat bouwen in de streng.
DNA template
- plasmide DNA
- genomisch DNA uit de cel
- cDNA (mRNA uit de cel geïsoleerd en vervolgens via reverse trans omgezet naar cDNA) coderende
delen van het gen. Alle intronen zijn eruit.
Hoeveelheid DNA template moet niet te hoog maar ook niet te laag zijn. Te hoog verstoord PCR
reactie.
DNA polymerase
Taq DNA polymerase: uit warme bron bacterie, heft geen proofreading.
pfu DNA polymerase: proofreading activiteit. Maakt minder fouten
,Primer design.
Eerst de kanten van het DNA bepalen.
loaction
,Conditions for a good primer
* 50-60% CG. Meer waterstofbruggen vormen. Binden goed aan het DNA.
* 3’eind moet aan het uiteinde een C of G hebben, omdat de binding dan steviger is en dan kan de
polymerase dit als startpunt gebruiken.
* het kan zijn dat als er sequenties in je primer zitten die complementair zijn aan elkaar, kan de
primer zich dubbelvouwen. Dan kunnen die complementaire nucleotiden aan elkaar binden en dan is
hij niet bruikbaar want dan zit de primer dubbel gevouwen in plaats van dat hij op het DNA kan gaan
binden. Dat dubbelvouwen noemen we een hairpin formation.
* wat we ook niet willen is dat sequenties in zitten die aan elkaar gaan zitten primer dimer
formation.
* afstand tussen de primers is 1 tot 2 kb, maar niet groter. Hangt wel af van het gen. (voor normale
PCR)
* Annealing temperatuur 55-65 graden Celsius. De temperatuur waarbij de primer goed en specifiek
op je DNA gaat vast zitten. Primers mogen niet te veel verschillen in de annealing temperatuur, niet
meer dan 5 graden celcius.
ATG is startcodon.
TGA is stopcodon.
Primers zijn tussen de 19-24 nucleotide
The PCR program
wat gebeurd er tijdens de stappen en waarom hebben we die nodig?
Denaturatie, annealing en elongatie
denatureren
annealing
elongatie
, Denatureren: DNA template uit elkaar smelten, zodat de primers kunnen binden.
Annealing: startpunt geven voor DNA polymerase om het DNA te verlengen.
Elongatie: verlengen van het DNA.
- deze stappen herhaal je een aantal keer.
Op welke temperatuur en waarom?
rond de 95 graden, maar het hangt af van de DNA polymerase die je gebruikt.
Primers annealing temperatuur: tussen de 55 en 65 graden afhankelijk van de primerset.
Elongatie temperatuur: 72 graden.
opslag tussen de 4 en 14 graden.
te hoge temperatuur?
DNA polymerase is een eiwit, dus deze kan niet tegen te hoge temperaturen en denatureert hij
zichzelf. Optimale temperaturen.
Annealing temperatuur: te laag? de primers binden niet op de juiste plek aan het DNA template.
De moleculen bewegen namelijk niet zo hard.
temperatuur te hoog? De moleculen bewegen te hard waardoor de primers los laten.
elongatie/extension: hoge temperatuur zodat de polymerase er af gaat.
Wat gebeurd er als de annealing temperatuur tijdens PCR te laag is gezet voor de primers?
Dan krijg je a-specifieke binding en als je pech hebt een a-specifiek product
En een te hoge annealing temperatuur?
De moleculen bewegen teveel dat de primers losraken. Ze kunnen niet binden. je krijgt geen PCR
product
Wat gebeurd er als de annealing temperatuur tijdens de PCR alleen maar goed is voor één primer?
De andere primer komt op de verkeerde plek te zitten, a-specifieke binding.
Plasmide in DNA
cloning vector
