samenvatting moleculaire biologie en DNA technieken

DEEL A: DNA
1. Introductie
1.1 Stroom van genetische informatie = centraal dogma
Interesse?
 Fenotypische kenmerken
 Functioneel onderzoek
 Ziektebeelden
Belang human genome project op medisch vlak:
 4000 genetisch bepaalde ziekten
 Diagnose gekende en nieuwe ziekte genen
 Onderzoek naar complexe genetische ziekten
o Auto-immuunziekten
o Kanker
o Hart-en vaatziekten
o Verslaving
o Depressiviteit
Centraal dogma:
=informatie in DNA via een RNA molecule doorgegeven aan eiwitten
Francis Crick (1957)
Behoud en doorgeven genetische info essentieel voor leven
Replicatie: DNA overgeschreven naar DNA
transcriptie: DNA overgeschreven naar RNA
Translatie: DNA vertaald naar EW
Genexpresie:
=proces waarbij informatie in gen tot expressie gebracht wordt doordat het gen
afgelezen wordt en door RNA en EW worden gemaakt
 2 belangrijke stappen: transcriptie + translatie
Evolutie centrale dogma:
 Strikte regulatie van expressie op verschillende niveau’s
 Variabiliteit tot gevolg




1.2 Structuur van DNA

,1.2.1 Primaire structuur
DNA = desoxyribonucleïnezuur
 Bevat alle erfelijke informatie van organisme
 Polymeer van nucleotiden
Nucleotiden:
 Ribose (pentose suiker)
 Fosfaatgroep
 N-base:
o Adenine (A), guanine (G)
o Cytosine (C), thymine (T), uracil (U)
 Verschillen van elkaar door N-houdende base
 Karakteristieke groep nucleotide
 Verantwoordelijk voor naamgeving




Polymerisatie nucleotiden:
 Condensatie reacties
 Fosfordiester binding tussen 3’ OH en 5’ fosfaatgroep volgende
 Zeer stabiele (covalente) binding
 DNA streng = primaire structuur
o 2 verschillende uiteinden
o Richting: 5’  3’ (polariteit)
o Suiker-fosfaat ruggengraat
o Ruggengraat altijd zelfde, N-basen zorgen voor variatie
o DNA-sequentie = volgorde van nucleotiden in een streng
o Negatieve ladingen
1.1.2 Secundaire structuur
Dubbele helix vorm:
 Watson en crick
 2 anti-parallele DNA-strengen
 Met complementaire baseparing
o A-T (2 H-bruggen)
o G-C (3 H-bruggen)
Structuur ondersteund door zwakke krachten:
 Waterstofbruggen tussen complementaire basen
 Base ‘stacking + elektrostatische interacties (van der waals)

,  Door hydrofobe basen dicht op elkaar
Omwentelingen
 grote en kleine groeve
interactie plaat met DNA bindende EW
1.2.3 Tertiaire structuur
Prokaryoot:
 Genoom is 1 circulair, dubbelstrengig DNA molecuul
 Geen vrij 3’ en/of 5’ uiteinde
 Complex met EW
 Vaak extrachromosomaal DNA: circulair ds plasmiden
 Vaak supercoiling: over- of onderwinding
Eukaryoot genoom:
 Chromosomaal DNA in kern als chromatine en chromosomen
o Chromosomen enkel zichtbaar tijdens metafase van mitose
o Bestaat uit 2 identieke chromatiden
 Dubbelstrengig lineair
 Eukaryoot chromosoom kan worden ontwonden tot verschillende niveau’s
 DNA-draad’ van 2m lengte in elke celkern
 Negatieve ladingen stoten elkaar af
 Geassocieerd met histonen ter vorming van nucleosomen
 Sterke opvouwing met verschillende niveaus zichtbaar met EM
Nucleosoom:
 8 kern histonen waarrond DNA gewonden
 Linker histon ter stabilisatie
 Condensatie door basische EW
 Rol in toegankelijkheid
 Rol in transcirptie
Verschillende verpakkingsgraden:
 Heterochromatine: compact
o Constitutief heterochomatine:
structurele rol, permanent gecondenseerd
o Facultatief: kan omgezet worden in euchromatine en omgekeerd
 Euchromatine: losser
 Veel van chromatine in metabolisch actieve cellen
 Ter voorbereiding van celdeling wordt alle chromatine dens opgevouwen
1.3 Organisatie van het genoom
Genoom:
=geheel aan genetische informatie van het organisme

,  Meestal DNA
 Enkel- (ss) of dubbelstrengig (ds)
 Lineair of circulair
Elke cel bevat volledige genoom
slechts deel tot expressie
Sterke variatie in genoomgrootte
=hoeveelheid DNA in haploïd genoom (in aantal bp)
Complexiteit organisme niet evenredig met genoomgrootte
Sterke variatie aantal chromosomen tussen soorten
Sterke variatie in efficiëntie van gebruik genoom
 90% prokayroot genoom uit EW-coderende genen
 <2% menselijk genoom uit EW-coderende genen
Humaan genoom project:
Nog veel onontdekt of slecht begrepen
Gen:
 Stuk DNA dat vertaald wordt naar EW = coderende DNA
 Niet coderende elementen (promotor, introns,..)
 Functionele RNA’s
1. Exonen en intronen:
o Exonen: coderende regio’s
informatie voor EWsynthese
o Intronen: niet coderende regio’s
worden verwijderd tijdens RNA-splicing maar spelen regulerende rol
2. Promotor- en regulatorische sequenties:
o Voor elk gen promotorsequenties die expressie reguleren
o Enhancers en silencers liggen ver weg van genen maar hebben
invloed op de activiteit
3. Genclusters:
o Sommige genen in clusters
o Bevatten meerdere genen die vaak gerelateerd zijn aan eenzelfde
biologische functie
4. Niet coderende RNA’s:
o Belangrijke regulerende functies (rRNA, tRNA, miRNA,..)


5. Repetitieve niet-coderende sequenties
o Aanzienlijk deel
o Gemiddelde tot hoog repetitief DNA
o Vaak structurele en evolutionair functie of onbekend
Tandem repeats: