Methoden H4: DNA-analyse
3.4 EIWITTEN
- Complexe klasse van moleculen
- > 100.000 verschillende soorten (zoals enzymen, …)
- Veel verschillende structuren
- Grote verscheidenheid aan functies
- Dynamische regeling (modificaties etc)
- Direct betrokken bij fysiologie en pathologie
- Directe doelwitten voor therapie en/of geneesmiddelen
= dus belangrijke focus van onderzoek via een verscheidenheid aan methoden
Wanneer je met eiwitten gaat werken, volg je eigenlijk deze stappen. Er wordt van ons
verwacht dat je weet hoe je deze dingen moet doen.
• Elektroforese (gebruik van stroom)
• Chromatografie (GEEN gebruik van stroom)
• (Centrifugale) filters
• …
à Dit hoofdstuk gaat vooral over hoe je eiwitsequenties kan uitlezen.
,3.4.1 EIWITSEQUENTIEBEPALING (IDENTIFICATIE)
Edman degradatie
= klassieke methode die al heel lang bestaat
Je moet dit NIET kunnen tekenen, je moet gewoon begrijpen wat er gebeurt.
Bedoeling: via een chemische reactie de eiwitsequentie te bepalen.
- Reagens toevoegen (PITC) met een benzeenring/aromatische ring: deze
absorbeert licht en is dus makkelijk te detecteren
- Aromatische ring zal aan de AZ komen te zitten zodat je ze makkelijk kan
detecteren.
- De koolstofgroep aan de rechterkant heeft graag extra elektronen (S zuigt
elektronen van C) à elektronen komen van de Aminoterminus van je AZ à AZ en
PITC binden aan elkaar
- Het laatste AZ wordt uiteindelijk afgesplitst + zit gebonden aan de aromatische
ring à dit product is makkelijk te herkennen
Ring en AZ scheiden via HPLC en zo het signaal te meten: de tijd dat het duurt voordat
het AZ langs de detector gepasseerd is, zegt iets over de identiteit van het eiwit.
- De cyclus wordt herhaald met het eiwit dat nu 1 terminaal AZ heeft afgegeven
= signalen zullen telkens 1 AZ per keer komen en zo kan je de sequentie uitlezen.
, • Sequentiebepaling volgens Edman degradatie is omslachtig
• 20 à 25 AZ per peptide: niet veel maar wel voldoende om een eiwit te
identificeren
§ Moeilijker voor nieuwe eiwitten
§ Moeilijker om meerdere eiwitten te bekijken
§ Ideal voor het bekijken van 1 opgezuiverd eiwit
• Nu geautomatiseerd à goed bruikbaar voor N-terminale eiwit-identificatie
• Eiwitsequenties opgeslagen in databanken
Bijvoorbeeld: SWISS-PROT
• Volledige sequentie wordt dikwijls afgeleid van DNA (als je een aantal AZ hebt,
kan je daar het DNA van maken en op basis van die informatie voorspellen hoe
de rest van je eiwit eruit ziet).
• Nu meer en meer sequentiebepaling via massaspectrometrie
Massa-spectrometrie
Onderscheiden van 2 (en een paar andere) klassen in massa-spectrometrie
A) ESI en MSMS: moleculen een lading geven (want als het geen lading heeft, kan je
het met massa-spectrometrie NIET zien!!)
§ MSMS: fragmentatie-stap à 2 keer de massa van het molecule meten
§ MS: klassieke meting (scheiding van molecule met liquid
chromatography, elektrospray ionization om molecule een lading te
geven, massa van het intacte molecule meten en NIET fragmenteren)
, Je vertrekt van een biologisch staal dat je homogeniseert & hier de eiwitten uithaalt.
• Je kan kiezen of je je preparaat op een kolom scheidt of niet.
§ Eiwitten rechtstreeks in ionisatiesysteem steken = shotgun-proteomics.
§ Eiwitten op voorhand scheiden (meestal) omdat eiwitten vaak dezelfde
massa hebben in een grote hoeveelheid eiwitten (en als ze dezelfe massa
hebben kan je ze niet van elkaar onderscheiden).
= via hydrofiele OF hydrofobe liquid chromatography
• Moleculen komen uit het systeem in functie van de tijd en je moet ze een
lading geven.
§ Elektrospray ionisation = je vloeistofje komt uit een kleine cappilair onder
hoge druk + op het einde van de cappilair zet je een hoge spanning zodat
de moleculen die passeren een lading krijgen
§ Geladen moleculen komen in een vaccuum = quadrupool (= 4 metalen
staven waar een wisselstroom over zit à afhankelijk van die stroom gaan
moleculen met een bepaalde lading en massa tussen die staven
occileren à afhankelijk van de massa is die schommeling anders).
= massa meten van de in tacte moleculen die uit de kolom komen
• Extra informatie nodig over de moleculen, dus we moeten ze fragmenteren
via een collision cell.
§ MS1/Q1 = Moleculen komen van de quadrupool in een kamer met inert
gas: de moleculen botsen met dit gas en breken zo op in kleinere
fragmenten (hoe meer energie de moleculen hebben, hoe harder ze
botsen en dus hoe kleiner ze worden).
§ MS2/Q2 = massa van de fragmenten worden hier gemeten
• Via een detector kan je stroomveranderingen meten.
§ Dit is waarom de moleculen een lading moeten krijgen: anders zouden ze
niet bewegen en niet kunnen worden aangetrokken/gemeten door de
detector.
Quadrupool heeft een beperkt oplossend vermogen (niet super goede resolutie voor
massa) à moleculen die BIJNA dezelfde massa hebben, kan je niet van elkaar
onderscheiden.
ð Oplossing: Orbitrap-systeem
o Kamer waar ionen in gevangen worden: ionen vormen cirkels rond een
spoelvormige elektrode
o Hier kan je een bepaalde golflengte opzetten waardoor de ionen
beginnnen occileren
3.4 EIWITTEN
- Complexe klasse van moleculen
- > 100.000 verschillende soorten (zoals enzymen, …)
- Veel verschillende structuren
- Grote verscheidenheid aan functies
- Dynamische regeling (modificaties etc)
- Direct betrokken bij fysiologie en pathologie
- Directe doelwitten voor therapie en/of geneesmiddelen
= dus belangrijke focus van onderzoek via een verscheidenheid aan methoden
Wanneer je met eiwitten gaat werken, volg je eigenlijk deze stappen. Er wordt van ons
verwacht dat je weet hoe je deze dingen moet doen.
• Elektroforese (gebruik van stroom)
• Chromatografie (GEEN gebruik van stroom)
• (Centrifugale) filters
• …
à Dit hoofdstuk gaat vooral over hoe je eiwitsequenties kan uitlezen.
,3.4.1 EIWITSEQUENTIEBEPALING (IDENTIFICATIE)
Edman degradatie
= klassieke methode die al heel lang bestaat
Je moet dit NIET kunnen tekenen, je moet gewoon begrijpen wat er gebeurt.
Bedoeling: via een chemische reactie de eiwitsequentie te bepalen.
- Reagens toevoegen (PITC) met een benzeenring/aromatische ring: deze
absorbeert licht en is dus makkelijk te detecteren
- Aromatische ring zal aan de AZ komen te zitten zodat je ze makkelijk kan
detecteren.
- De koolstofgroep aan de rechterkant heeft graag extra elektronen (S zuigt
elektronen van C) à elektronen komen van de Aminoterminus van je AZ à AZ en
PITC binden aan elkaar
- Het laatste AZ wordt uiteindelijk afgesplitst + zit gebonden aan de aromatische
ring à dit product is makkelijk te herkennen
Ring en AZ scheiden via HPLC en zo het signaal te meten: de tijd dat het duurt voordat
het AZ langs de detector gepasseerd is, zegt iets over de identiteit van het eiwit.
- De cyclus wordt herhaald met het eiwit dat nu 1 terminaal AZ heeft afgegeven
= signalen zullen telkens 1 AZ per keer komen en zo kan je de sequentie uitlezen.
, • Sequentiebepaling volgens Edman degradatie is omslachtig
• 20 à 25 AZ per peptide: niet veel maar wel voldoende om een eiwit te
identificeren
§ Moeilijker voor nieuwe eiwitten
§ Moeilijker om meerdere eiwitten te bekijken
§ Ideal voor het bekijken van 1 opgezuiverd eiwit
• Nu geautomatiseerd à goed bruikbaar voor N-terminale eiwit-identificatie
• Eiwitsequenties opgeslagen in databanken
Bijvoorbeeld: SWISS-PROT
• Volledige sequentie wordt dikwijls afgeleid van DNA (als je een aantal AZ hebt,
kan je daar het DNA van maken en op basis van die informatie voorspellen hoe
de rest van je eiwit eruit ziet).
• Nu meer en meer sequentiebepaling via massaspectrometrie
Massa-spectrometrie
Onderscheiden van 2 (en een paar andere) klassen in massa-spectrometrie
A) ESI en MSMS: moleculen een lading geven (want als het geen lading heeft, kan je
het met massa-spectrometrie NIET zien!!)
§ MSMS: fragmentatie-stap à 2 keer de massa van het molecule meten
§ MS: klassieke meting (scheiding van molecule met liquid
chromatography, elektrospray ionization om molecule een lading te
geven, massa van het intacte molecule meten en NIET fragmenteren)
, Je vertrekt van een biologisch staal dat je homogeniseert & hier de eiwitten uithaalt.
• Je kan kiezen of je je preparaat op een kolom scheidt of niet.
§ Eiwitten rechtstreeks in ionisatiesysteem steken = shotgun-proteomics.
§ Eiwitten op voorhand scheiden (meestal) omdat eiwitten vaak dezelfde
massa hebben in een grote hoeveelheid eiwitten (en als ze dezelfe massa
hebben kan je ze niet van elkaar onderscheiden).
= via hydrofiele OF hydrofobe liquid chromatography
• Moleculen komen uit het systeem in functie van de tijd en je moet ze een
lading geven.
§ Elektrospray ionisation = je vloeistofje komt uit een kleine cappilair onder
hoge druk + op het einde van de cappilair zet je een hoge spanning zodat
de moleculen die passeren een lading krijgen
§ Geladen moleculen komen in een vaccuum = quadrupool (= 4 metalen
staven waar een wisselstroom over zit à afhankelijk van die stroom gaan
moleculen met een bepaalde lading en massa tussen die staven
occileren à afhankelijk van de massa is die schommeling anders).
= massa meten van de in tacte moleculen die uit de kolom komen
• Extra informatie nodig over de moleculen, dus we moeten ze fragmenteren
via een collision cell.
§ MS1/Q1 = Moleculen komen van de quadrupool in een kamer met inert
gas: de moleculen botsen met dit gas en breken zo op in kleinere
fragmenten (hoe meer energie de moleculen hebben, hoe harder ze
botsen en dus hoe kleiner ze worden).
§ MS2/Q2 = massa van de fragmenten worden hier gemeten
• Via een detector kan je stroomveranderingen meten.
§ Dit is waarom de moleculen een lading moeten krijgen: anders zouden ze
niet bewegen en niet kunnen worden aangetrokken/gemeten door de
detector.
Quadrupool heeft een beperkt oplossend vermogen (niet super goede resolutie voor
massa) à moleculen die BIJNA dezelfde massa hebben, kan je niet van elkaar
onderscheiden.
ð Oplossing: Orbitrap-systeem
o Kamer waar ionen in gevangen worden: ionen vormen cirkels rond een
spoelvormige elektrode
o Hier kan je een bepaalde golflengte opzetten waardoor de ionen
beginnnen occileren
