Fleury Kassandra Mars 2021
Cahier de laboratoire – OMEE
Identification moléculaire d’un Arthropode
par DNA barcoding
2021G6B2_EFKF
Enseignants :
Coordinateur des TP :
1
,Sommaire
I. Echantillonnage et conservation des arthropodes aquatiques ...........................................................3
II. Extraction ADN génomique non destructive (lyse par Chelex + PK)....................................................3
III. Amplification par PCR et séquençage des gènes du COI et 16S.........................................................3
1. Mix PCR...........................................................................................................................................3
2. Amplification du gène COI et du gène de l’ARN 16S (PCR).............................................................4
3. Migration des produits de PCR COI et 16S sur gel d’agarose..........................................................5
A. Préparation gel d’agarose...........................................................................................................5
B. Préparation et dépôt des échantillons d’ADN............................................................................6
C. Résultats.....................................................................................................................................6
IV. Séquençage (arthropodes) par méthode Sanger ..............................................................................7
V. Logiciels............................................................................................................................................11
VI. Annexes...........................................................................................................................................12
2
, I. Echantillonnage et conservation des arthropodes
aquatiques
Date : 1.03.2021
Site : Etang La Doua, Villeurbanne.
Échantillonnage invasif à l’aide de surbers permettant de choisir un arthropode
vivant au sein de l’étang.
La conservation des organismes a été réalisée avec de l’éthanol dans des tubes à
vis au sein duquel une étiquette a été placée avec le code binôme :
2021G6B2_EFKE.
L’ADN est conservé par déshydratation dans de l’éthanol, ce qui permet de
stopper l’activité enzymatique et éviter la dégradation de l’ADN.
Une fiche d’échantillonnage (annexe 1) a été remplie en parallèle de
l’échantillonnage.
II. Extraction ADN génomique non destructive (lyse
par Chelex + PK)
Date : 1.03.2021
- À l’aide d’une pince flambée, prélèvement de 3 pattes de l’échantillon
préalablement épongé sur du papier absorbant.
- Placer l’échantillon dans un microtube de 0.2mL contenant 150µL d’une
solution de Chelex à 7% (prélèvement à la p200).
- Ajout de 7.5µL de protéinase K (PK, 20mg/mL) (prélèvement à la p10).
- Incubation à 56°c pendant 3h (début à 10h).
- Dénaturation de la PK : 15 min à 95°c (début à 13h).
- Culottage des billes de Chelex par un spin.
- Tube conservé à 4°c.
III. Amplification par PCR et séquençage des gènes
du COI et 16S
1. Mix PCR
Date : 1.03.2021
Volume (µL) Volume Mégamix (x4) (µL) Concentrations finales
H2O distillée 18.15 72.6 (p100) X
Tampon 10X 2.5 10 (p10) 1
dNTP 10mM chacun 0.5 2 (p2) 0.2mM
Amorce(s) sens 10µM 0.7 2.8 (p10) 0.28µM
Amorce(s) antisens 0.7 2.8 (p10) 0.28µM
10µM
3
Tableau 1 : mélange réactionnel
Cahier de laboratoire – OMEE
Identification moléculaire d’un Arthropode
par DNA barcoding
2021G6B2_EFKF
Enseignants :
Coordinateur des TP :
1
,Sommaire
I. Echantillonnage et conservation des arthropodes aquatiques ...........................................................3
II. Extraction ADN génomique non destructive (lyse par Chelex + PK)....................................................3
III. Amplification par PCR et séquençage des gènes du COI et 16S.........................................................3
1. Mix PCR...........................................................................................................................................3
2. Amplification du gène COI et du gène de l’ARN 16S (PCR).............................................................4
3. Migration des produits de PCR COI et 16S sur gel d’agarose..........................................................5
A. Préparation gel d’agarose...........................................................................................................5
B. Préparation et dépôt des échantillons d’ADN............................................................................6
C. Résultats.....................................................................................................................................6
IV. Séquençage (arthropodes) par méthode Sanger ..............................................................................7
V. Logiciels............................................................................................................................................11
VI. Annexes...........................................................................................................................................12
2
, I. Echantillonnage et conservation des arthropodes
aquatiques
Date : 1.03.2021
Site : Etang La Doua, Villeurbanne.
Échantillonnage invasif à l’aide de surbers permettant de choisir un arthropode
vivant au sein de l’étang.
La conservation des organismes a été réalisée avec de l’éthanol dans des tubes à
vis au sein duquel une étiquette a été placée avec le code binôme :
2021G6B2_EFKE.
L’ADN est conservé par déshydratation dans de l’éthanol, ce qui permet de
stopper l’activité enzymatique et éviter la dégradation de l’ADN.
Une fiche d’échantillonnage (annexe 1) a été remplie en parallèle de
l’échantillonnage.
II. Extraction ADN génomique non destructive (lyse
par Chelex + PK)
Date : 1.03.2021
- À l’aide d’une pince flambée, prélèvement de 3 pattes de l’échantillon
préalablement épongé sur du papier absorbant.
- Placer l’échantillon dans un microtube de 0.2mL contenant 150µL d’une
solution de Chelex à 7% (prélèvement à la p200).
- Ajout de 7.5µL de protéinase K (PK, 20mg/mL) (prélèvement à la p10).
- Incubation à 56°c pendant 3h (début à 10h).
- Dénaturation de la PK : 15 min à 95°c (début à 13h).
- Culottage des billes de Chelex par un spin.
- Tube conservé à 4°c.
III. Amplification par PCR et séquençage des gènes
du COI et 16S
1. Mix PCR
Date : 1.03.2021
Volume (µL) Volume Mégamix (x4) (µL) Concentrations finales
H2O distillée 18.15 72.6 (p100) X
Tampon 10X 2.5 10 (p10) 1
dNTP 10mM chacun 0.5 2 (p2) 0.2mM
Amorce(s) sens 10µM 0.7 2.8 (p10) 0.28µM
Amorce(s) antisens 0.7 2.8 (p10) 0.28µM
10µM
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Tableau 1 : mélange réactionnel
