ZSO 7
Recombinant DNA-technologie en genoomanalyse 2
genetische manipulatie
= recombinant DNA-techniek gebruiken om genen manipuleren voor genetische analyse of
om producten / toepassingen ontwikkelen
vector = DNA molecule dat gebruikt wordt op gensequenties te amplificeren
genklonering = het inbrengen van genetisch materiaal in een vector om specifieke
genen te isoleren
eigenschappen van bruikbare vectoren:
- vector DNA kan in een gastheercel gebracht worden
- vector bevat replicatie origin zodat het kan repliceren in een gastheercel
- gastheercellen die vector bevatten kunnen gemakkelijk worden
geidentificeerd vanwege de aanwezigheid van antibioticumresistentiegen of
andere selecteerbare marker
- 1 of meer unieke splitsingsplaatsen voor restrictie-enzymen
Veelzijdige vectoren voor meer dan simpel kloneren
Shuttle vectoren
= vectoren die in 2 of meer gastheerorganismen kunnen worden geïntroduceerd
→ worden door 1 van deze organismen onderhouden
→ E. Coli vaak 1 van deze organismen
kloneringsvectoren gebruikt om DNA in E. Coli te klonen
E. Coli = bacterie → perfect studie organisme
- haploid: mutatie komt meteen tot uiting
- makkelijk te groeien
- vermenigvuldigen snel (om 20 minuten)
Expressie vectoren
= kloneringsvectoren die de noodzakelijke regulerende sequenties bevat om transcriptie en
translatie van gekloond gen mogelijk te maken
→ gebruikt om eiwit te produceren dat wordt gecodeerd door gekloneerd gen in
getransformeerde gastheer
→ productie farmaceutisch actieve eiwitten m.b.v. expressievectoren + geschikte gastheer
kenmerken expressie vectoren:
- promotor stroomopwaarts van multiple cloning site
- transcriptie terminator stroomafwaarts van multiple cloning site
- DNA sequentie coderend voor Shine-Dalgarno voor initiatie translatie tussen
promotor en terminator
, poli linker = aaneenschakeling van herkenning DNA sequenties
bacterien vector opgenomen → vectorresistent → leven ze enkel in omgeving met
ampiciline
inducer: kleurloze stof gaat omgezet worden in blauwe kleur = functioneel
eukaryote proteïnen maken in E. Coli m.b.v. expressie vectoren
● gebruik cDNA
→ bevat introns (kunnen niet uit transcripten in E. Coli verwijderd worden)
→ cDNA gemaakt van mRNA-transcripten van gen
→ primers en reverse transcriptase:
maken dubbelstrengige DNA kopie van mRNA
● cDNA in vector plaatsen m.b.v. restrictie site linkers aan elk uiteinde van het cDNA
● recombinant plasmide inbrengen in E. Coli
● expressie cDNA
- onder controle van promotor op expressievector
- Shine-Dalgarno sequentie toegevoegd aan het 5’ uiteinde van het mRNA
→ transcriptie kan worden getransleerd
● translatie genereert de polypeptideketen gecodeerd door het gekloneerde cDNA
Problemen om klonen te construeren met gebruik van een expressie vector
Een cDNA dat geknipt wordt met restrictie enzymen kunnen gelegen zijn op 2 manieren
- Correct georiënteerd:
→ transcriptie produceert een mRNA
Recombinant DNA-technologie en genoomanalyse 2
genetische manipulatie
= recombinant DNA-techniek gebruiken om genen manipuleren voor genetische analyse of
om producten / toepassingen ontwikkelen
vector = DNA molecule dat gebruikt wordt op gensequenties te amplificeren
genklonering = het inbrengen van genetisch materiaal in een vector om specifieke
genen te isoleren
eigenschappen van bruikbare vectoren:
- vector DNA kan in een gastheercel gebracht worden
- vector bevat replicatie origin zodat het kan repliceren in een gastheercel
- gastheercellen die vector bevatten kunnen gemakkelijk worden
geidentificeerd vanwege de aanwezigheid van antibioticumresistentiegen of
andere selecteerbare marker
- 1 of meer unieke splitsingsplaatsen voor restrictie-enzymen
Veelzijdige vectoren voor meer dan simpel kloneren
Shuttle vectoren
= vectoren die in 2 of meer gastheerorganismen kunnen worden geïntroduceerd
→ worden door 1 van deze organismen onderhouden
→ E. Coli vaak 1 van deze organismen
kloneringsvectoren gebruikt om DNA in E. Coli te klonen
E. Coli = bacterie → perfect studie organisme
- haploid: mutatie komt meteen tot uiting
- makkelijk te groeien
- vermenigvuldigen snel (om 20 minuten)
Expressie vectoren
= kloneringsvectoren die de noodzakelijke regulerende sequenties bevat om transcriptie en
translatie van gekloond gen mogelijk te maken
→ gebruikt om eiwit te produceren dat wordt gecodeerd door gekloneerd gen in
getransformeerde gastheer
→ productie farmaceutisch actieve eiwitten m.b.v. expressievectoren + geschikte gastheer
kenmerken expressie vectoren:
- promotor stroomopwaarts van multiple cloning site
- transcriptie terminator stroomafwaarts van multiple cloning site
- DNA sequentie coderend voor Shine-Dalgarno voor initiatie translatie tussen
promotor en terminator
, poli linker = aaneenschakeling van herkenning DNA sequenties
bacterien vector opgenomen → vectorresistent → leven ze enkel in omgeving met
ampiciline
inducer: kleurloze stof gaat omgezet worden in blauwe kleur = functioneel
eukaryote proteïnen maken in E. Coli m.b.v. expressie vectoren
● gebruik cDNA
→ bevat introns (kunnen niet uit transcripten in E. Coli verwijderd worden)
→ cDNA gemaakt van mRNA-transcripten van gen
→ primers en reverse transcriptase:
maken dubbelstrengige DNA kopie van mRNA
● cDNA in vector plaatsen m.b.v. restrictie site linkers aan elk uiteinde van het cDNA
● recombinant plasmide inbrengen in E. Coli
● expressie cDNA
- onder controle van promotor op expressievector
- Shine-Dalgarno sequentie toegevoegd aan het 5’ uiteinde van het mRNA
→ transcriptie kan worden getransleerd
● translatie genereert de polypeptideketen gecodeerd door het gekloneerde cDNA
Problemen om klonen te construeren met gebruik van een expressie vector
Een cDNA dat geknipt wordt met restrictie enzymen kunnen gelegen zijn op 2 manieren
- Correct georiënteerd:
→ transcriptie produceert een mRNA
