Inhoud
Classificatie en naamgeving........................................................................3
1.1 Biokatalysatoren versus chemische katalysatoren.............................4
1.2 Naamgeving........................................................................................5
1.3 Classificatie.........................................................................................5
1.3.1 Oxidoreductase (EC1)...................................................................5
1.3.2 Transferases (EC2).......................................................................6
1.3.3 Hydrolase (EC3)............................................................................6
1.3.4 Lyases (EC4).................................................................................7
1.3.5 Isomerases (EC5)..........................................................................8
1.3.6 Ligases (EC6)................................................................................8
1.4 Enzym structuren................................................................................9
1.4.1 Primaire structuur.........................................................................9
1.4.2 Secundaire structuur....................................................................9
1.4.3 Tertiaire structuur.........................................................................9
1.4.4 Quaternaire structuur...................................................................9
1.5 Cofactoren en cosubstraten..............................................................10
1.5.1 Cofactor......................................................................................10
2 Enzymkatalyse........................................................................................11
2.1 Active plaats.....................................................................................11
2.2 Gibbs-vrije-energie............................................................................11
2.3 Activatie energie...............................................................................13
2.4 Afname van activatie energie...........................................................14
2.4.1 Nabijheid en oriëntatie...............................................................14
2.4.2 Stabilisatie transitietoestand......................................................14
2.4.3 Induced fit...................................................................................15
2.4.4 Reactieve groepen in AZ zijketens.............................................15
2.4.5 Cofactoren..................................................................................17
3 Enzymkinetiek.........................................................................................18
3.1 Orde van een reactie........................................................................18
3.2 Michaelis-Menten kinetiek.................................................................18
3.2.1 Afleiding van de formule.............................................................18
, 3.2.2 KM:...............................................................................................20
3.2.3 Turnovergetal kcat:......................................................................20
4 Enzyminhibitie en -activatie....................................................................23
4.1 Inhibitoren.........................................................................................23
4.1.1 Competitieve..............................................................................23
4.1.2 Gemengde reversibele inhibitor.................................................24
4.2 Invloeden op de enzymreactie..........................................................27
4.2.1 Invloed van pH op het enzym.....................................................27
4.2.2 Invloed van temperatuur op het enzym.....................................28
5 Bepalen van de specifieke activiteit (U/mg)............................................29
5.1 Bepalen van proteïne concentratie (mg/ml).....................................29
5.2 Bepalen van de enzymatische activiteit (U/ml)................................30
5.2.1 Keuze van het instrument...........................................................30
5.2.2 keuze van de methode...............................................................30
5.2.3 Keuze van pH..............................................................................30
5.2.4 Keuze van buffer en ionische sterkte..........................................31
5.2.5 Keuze van solvent.......................................................................31
5.2.6 Keuze van temperatuur..............................................................31
5.2.7 Keuze van het substraat.............................................................32
5.2.8 Bepaling van de enzymatische activiteit....................................32
6 Industriële productie van enzymen.........................................................33
6.1 Bronnen van industriële enzymen....................................................33
6.2 Fermentatieproces............................................................................33
6.2.1 Natuurlijke producenten.............................................................33
6.2.2 Recombinanten...........................................................................33
6.2.3 Secretie.......................................................................................34
6.2.4 Type fermentatieprocessen........................................................35
6.2.5 Productie van industriële enzymen.............................................36
6.3 Protein engineering...........................................................................36
6.3.1 random mutagenese...................................................................37
6.3.2 Shuffeling....................................................................................37
7 Immobilisatie...........................................................................................39
7.1 Wat is immobilisatie?........................................................................39
, 7.2 Waarom enzymen immobiliseren?....................................................39
7.2.1 Hergebruik..................................................................................39
7.2.2 Eenvoudigere DSP......................................................................39
7.2.3 Verhoogde stabiliteit onder proces- en bewaarcondities............39
7.2.4 Verhoogde activiteit...................................................................40
7.3 Hoe enzymen immobiliseren............................................................40
7.3.1 Adsorptie door fysische en elektrostatische krachten................40
7.3.2 Adsorptie door covalente binding...............................................41
7.3.3 Immobilisatie door inkapseling...................................................41
7.3.4 Immobilisatie door crosslinking..................................................42
7.3.5 Binding aan dragermateriaal......................................................42
8 industriële enzymen................................................................................44
8.1 wasmiddelen.....................................................................................44
8.2 vaatwasmiddelen..............................................................................44
8.3 papier coating...................................................................................45
8.4 verwijderen hars van bomen............................................................45
8.5 productie dierenvoeding...................................................................46
8.6 productie dierenvoering (2)..............................................................46
8.7 1ste generatie bio EtOH......................................................................47
8.8 2de generatie bio EtOH......................................................................47
8.9 Gehalte acrymamide verlagen..........................................................47
9 Biosensoren............................................................................................49
9.1 Types biosensoren............................................................................49
9.1.1 Resonantie biosensor..................................................................49
9.1.2 Thermische biosensor.................................................................49
9.1.3 Elektrochemische biosensor.......................................................50
9.2 Enzymen in de medische sector......................................................51
9.2.1 Verschil met industrele enzymen...............................................51
Classificatie en naamgeving
Definitie van enzymtechnologie:
, In de enzymtechnologie – een subveld van de biotechnologie -
worden nieuwe processen ontwikkeld om zowel laagwaarde
(bulk-)producten als hoogwaarde producten te maken met
enzymen als biokatalysatoren. Enzymen kunnen ook aangewend
in allerlei processen, analytische metingen en diagnostica
Enzymen in het dagelijkste leven: jeans, wasproducten, tandpasta,...
Enzymen zijn (bio)katalysatoren:
Katalyseren is een kinetisch fenomeen waarbij de snelheid van
een chemische reactie wordt verhoogd met een katalysator die
zelf niet verschijnt in de stochiometrische vergelijking van een
chemische reactie.
Enzyme engineering = het modificeren van de enzymen zodat deze
geschikter zijn om het beoogde doel te bereiken. Enzyme engineering door
directe evolutie is de meest gebruikte strategie om de enzymen te
modificeren. (Hoofdstuk 6.3)
2 staps protocol voor enzyme engineering:
Creëren van moleculaire diversiteit door mutagenese of shuffeling.
De collectie van varianten wordt een bibliotheek genoemd (library)
Selectie van de geschikte variant, door high-throughput screening.
1.1 Biokatalysatoren versus chemische katalysatoren
Biokatalysatoren zijn specifieker en selectiever (voor zowel product
als substraat) dan chemische katalysatoren. (ortho/metha/para of
D/L configuraties)
Biokatalysatoren hebben minder tussenstappen nodig
Biokatalysatoren hebben milde proces omstandigheden nodig (temp,
druk, pH,..)
Biokatalysatoren hebben hogere reactiesnelheden
Chemische katalysatoren hebben minder opzuiverings en isolatie
kosten
Enzymen zijn vaak onstabiel uit hun natuurlijke omgeving
Classificatie en naamgeving........................................................................3
1.1 Biokatalysatoren versus chemische katalysatoren.............................4
1.2 Naamgeving........................................................................................5
1.3 Classificatie.........................................................................................5
1.3.1 Oxidoreductase (EC1)...................................................................5
1.3.2 Transferases (EC2).......................................................................6
1.3.3 Hydrolase (EC3)............................................................................6
1.3.4 Lyases (EC4).................................................................................7
1.3.5 Isomerases (EC5)..........................................................................8
1.3.6 Ligases (EC6)................................................................................8
1.4 Enzym structuren................................................................................9
1.4.1 Primaire structuur.........................................................................9
1.4.2 Secundaire structuur....................................................................9
1.4.3 Tertiaire structuur.........................................................................9
1.4.4 Quaternaire structuur...................................................................9
1.5 Cofactoren en cosubstraten..............................................................10
1.5.1 Cofactor......................................................................................10
2 Enzymkatalyse........................................................................................11
2.1 Active plaats.....................................................................................11
2.2 Gibbs-vrije-energie............................................................................11
2.3 Activatie energie...............................................................................13
2.4 Afname van activatie energie...........................................................14
2.4.1 Nabijheid en oriëntatie...............................................................14
2.4.2 Stabilisatie transitietoestand......................................................14
2.4.3 Induced fit...................................................................................15
2.4.4 Reactieve groepen in AZ zijketens.............................................15
2.4.5 Cofactoren..................................................................................17
3 Enzymkinetiek.........................................................................................18
3.1 Orde van een reactie........................................................................18
3.2 Michaelis-Menten kinetiek.................................................................18
3.2.1 Afleiding van de formule.............................................................18
, 3.2.2 KM:...............................................................................................20
3.2.3 Turnovergetal kcat:......................................................................20
4 Enzyminhibitie en -activatie....................................................................23
4.1 Inhibitoren.........................................................................................23
4.1.1 Competitieve..............................................................................23
4.1.2 Gemengde reversibele inhibitor.................................................24
4.2 Invloeden op de enzymreactie..........................................................27
4.2.1 Invloed van pH op het enzym.....................................................27
4.2.2 Invloed van temperatuur op het enzym.....................................28
5 Bepalen van de specifieke activiteit (U/mg)............................................29
5.1 Bepalen van proteïne concentratie (mg/ml).....................................29
5.2 Bepalen van de enzymatische activiteit (U/ml)................................30
5.2.1 Keuze van het instrument...........................................................30
5.2.2 keuze van de methode...............................................................30
5.2.3 Keuze van pH..............................................................................30
5.2.4 Keuze van buffer en ionische sterkte..........................................31
5.2.5 Keuze van solvent.......................................................................31
5.2.6 Keuze van temperatuur..............................................................31
5.2.7 Keuze van het substraat.............................................................32
5.2.8 Bepaling van de enzymatische activiteit....................................32
6 Industriële productie van enzymen.........................................................33
6.1 Bronnen van industriële enzymen....................................................33
6.2 Fermentatieproces............................................................................33
6.2.1 Natuurlijke producenten.............................................................33
6.2.2 Recombinanten...........................................................................33
6.2.3 Secretie.......................................................................................34
6.2.4 Type fermentatieprocessen........................................................35
6.2.5 Productie van industriële enzymen.............................................36
6.3 Protein engineering...........................................................................36
6.3.1 random mutagenese...................................................................37
6.3.2 Shuffeling....................................................................................37
7 Immobilisatie...........................................................................................39
7.1 Wat is immobilisatie?........................................................................39
, 7.2 Waarom enzymen immobiliseren?....................................................39
7.2.1 Hergebruik..................................................................................39
7.2.2 Eenvoudigere DSP......................................................................39
7.2.3 Verhoogde stabiliteit onder proces- en bewaarcondities............39
7.2.4 Verhoogde activiteit...................................................................40
7.3 Hoe enzymen immobiliseren............................................................40
7.3.1 Adsorptie door fysische en elektrostatische krachten................40
7.3.2 Adsorptie door covalente binding...............................................41
7.3.3 Immobilisatie door inkapseling...................................................41
7.3.4 Immobilisatie door crosslinking..................................................42
7.3.5 Binding aan dragermateriaal......................................................42
8 industriële enzymen................................................................................44
8.1 wasmiddelen.....................................................................................44
8.2 vaatwasmiddelen..............................................................................44
8.3 papier coating...................................................................................45
8.4 verwijderen hars van bomen............................................................45
8.5 productie dierenvoeding...................................................................46
8.6 productie dierenvoering (2)..............................................................46
8.7 1ste generatie bio EtOH......................................................................47
8.8 2de generatie bio EtOH......................................................................47
8.9 Gehalte acrymamide verlagen..........................................................47
9 Biosensoren............................................................................................49
9.1 Types biosensoren............................................................................49
9.1.1 Resonantie biosensor..................................................................49
9.1.2 Thermische biosensor.................................................................49
9.1.3 Elektrochemische biosensor.......................................................50
9.2 Enzymen in de medische sector......................................................51
9.2.1 Verschil met industrele enzymen...............................................51
Classificatie en naamgeving
Definitie van enzymtechnologie:
, In de enzymtechnologie – een subveld van de biotechnologie -
worden nieuwe processen ontwikkeld om zowel laagwaarde
(bulk-)producten als hoogwaarde producten te maken met
enzymen als biokatalysatoren. Enzymen kunnen ook aangewend
in allerlei processen, analytische metingen en diagnostica
Enzymen in het dagelijkste leven: jeans, wasproducten, tandpasta,...
Enzymen zijn (bio)katalysatoren:
Katalyseren is een kinetisch fenomeen waarbij de snelheid van
een chemische reactie wordt verhoogd met een katalysator die
zelf niet verschijnt in de stochiometrische vergelijking van een
chemische reactie.
Enzyme engineering = het modificeren van de enzymen zodat deze
geschikter zijn om het beoogde doel te bereiken. Enzyme engineering door
directe evolutie is de meest gebruikte strategie om de enzymen te
modificeren. (Hoofdstuk 6.3)
2 staps protocol voor enzyme engineering:
Creëren van moleculaire diversiteit door mutagenese of shuffeling.
De collectie van varianten wordt een bibliotheek genoemd (library)
Selectie van de geschikte variant, door high-throughput screening.
1.1 Biokatalysatoren versus chemische katalysatoren
Biokatalysatoren zijn specifieker en selectiever (voor zowel product
als substraat) dan chemische katalysatoren. (ortho/metha/para of
D/L configuraties)
Biokatalysatoren hebben minder tussenstappen nodig
Biokatalysatoren hebben milde proces omstandigheden nodig (temp,
druk, pH,..)
Biokatalysatoren hebben hogere reactiesnelheden
Chemische katalysatoren hebben minder opzuiverings en isolatie
kosten
Enzymen zijn vaak onstabiel uit hun natuurlijke omgeving
