Samenvatting Methoden 3
Inhoud
H2: DNA en genomics ............................................................................................................................................3
DNA SEQUENTIEBEPALING ................................................................................................................................3
DNA GENOTYPEREN ........................................................................................................................................12
DNA HYBRIDISEREN .........................................................................................................................................14
H3: RNA en transcriptomics ................................................................................................................................15
RNA MICRO-ARRAYS........................................................................................................................................16
RNA SEQUENCING (bulk) .................................................................................................................................17
SINGLE-CELL RNA SEQUENCING ......................................................................................................................18
SPATIAL TRANSCRIPTOMICS ............................................................................................................................20
H4: Eiwitten en proteomics .................................................................................................................................21
SEQUENTIEANALYSE ........................................................................................................................................21
PROTEOOMANALYSE .......................................................................................................................................22
3D-STRUCTUURBEPALING ...............................................................................................................................24
EIWIT-EIWIT INTERACTIES ...............................................................................................................................28
H5: Metabolieten en lipiden ...............................................................................................................................32
SPECIFIEKE TESTEN VAN INDIVIDUELE METABOLIETEN ..................................................................................32
METABOLOMICS ..............................................................................................................................................32
METABOLE FLUX ANALYSE (Fluxomics) ...........................................................................................................33
ANALYSE VAN LIPIDEN.....................................................................................................................................33
H6: Gentranscriptie .............................................................................................................................................37
NASCENT RNA ANALYSES (ontluikend RNA)....................................................................................................37
PROMOTOR-REPORTER STUDIES ....................................................................................................................39
ANALYSE VAN PROTEIN-DNA INTERACTIES .....................................................................................................39
H7: Data-analyse en databanken ........................................................................................................................42
LITERATUUR.....................................................................................................................................................42
DATA REPOSITORIA .........................................................................................................................................42
DATA PLATFORMEN ........................................................................................................................................42
DATA-ANALYSE ................................................................................................................................................43
1
,H8: Modulatie van genexpressie .........................................................................................................................45
ONDERDRUKKING VAN GENEXPRESSIE VIA ANTISENSE TECHNOLOGIE .........................................................45
GENDISRUPTIE, MUTAGENESE EN EDITING ....................................................................................................47
ECTOPISCHE EXPRESSIE EN OVEREXPRESSIE ...................................................................................................52
GERICHTE PROTEÏNE DEGRADATIE..................................................................................................................53
METHODE VAN GENTRANSFER .......................................................................................................................53
H9: Systeembiologie ............................................................................................................................................56
Synthetische biologie ......................................................................................................................................56
H10: Integreren en oplossen van vraagstellingen ...............................................................................................57
2
,H2: DNA en genomics
DNA SEQUENTIEBEPALING
- De novo genoom sequentiebepaling
o Ongekende genomen (bij allereerste keer)
o Nieuwe organismen, humaan genoom project
o Gedeeltelijk of volledig
- Resequencing
o Individuen tov referentiegenoom
o Verschillen tussen individuen (SNPs)
o Mutaties (ziektes)
o Construct verificatie
o Klinische toepassingen: diagnose, farmacogenetica,
NIPT
- Sequentiebepaling als teller
o Aantallen DNA (of RNA) moleculen
(seq moet gekend zijn)
o Zie RNAseq, ChIPseq
SANGER SEQUENCING = nieuwsynthese met dideoxy-ketenterminatie
- Template = clone of PCR amplicon
- Amplicon + primer + dNTPs + DNApol + ddNTP (fluo)
- Verschillende grootte van reads
- Scheiding strengen op gel of capillair → elektroferogram (eerste 30nt niet afleesbaar)
- Anti-sense reconstrueren → omzetten naar sense
- = beperkt tot 500 nt, moeite met herhalingen
- Voor betrouwbaarheid: twee aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
SHORT-READ NEXT-GENERATION SEQUENCING
➔ Doel: hogere throughput, lagere kost → massale DNA-sequentiebepaling mogelijk
➔ Richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor <1000$
- Parallelle detectie (massive parallel sequencing)
o Cluster of polony = kopien van DNA-template
o Klonale in vitro amplificatie van template → duizend-milj kopieën van DNA-template/cluster
o Multiplexing: vele clusters tegelijk
- Miniaturisatie van reacties
- Integratie van proces: directe detectie
3
, 1. Aanmaak DNA library
Types library:
- Whole genome sequencing
- Mate pair libraries
- Whole exome sequencing of targeted sequencing: door hybridisatie aan probes of PCR-gebaseerd
o WES = whole-exome sequencing
▪ Coderende sequentie (niet UTR)
▪ 1,5% v genoom
o Targeted sequencing = specifiek gewenste regio’s
- Amplicon sequencing: PCR amplicons
- cDNA library (RNAseq)
Procedure aanmaak library:
- Input DNA → kwaliteitscontrole
o Hoeveelheid en concentratie: verschillende methoden
o Zuiverheid, bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
o Integriteit, bv capillaire electroforese
- Random fragmentatie (sonicatie, nebulisatie, Dnase I,…)
- End repair
o Blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow fragment)
o 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase)
o Eventueel 3’ non-template A aanhechten (Taq polymerase)
- Adapters aanhechten
o Nodig voor PCR en sequencing primers + ev. indices/barcodes (per staal/molecule)
o Ligatie met fragment uiteinden (sticky end met 3’A overhang of blunt-end)
o Eventueel selectie van fragmenten met twee verschillende adaptoren
o Enkele PCR cycli: fragment met adapters amplificeren, high-fidelity polymerasen met min. bias (bv.
GC%)
o Alternatief: tagmentatie: fragmentatie en adapters aanhechten in één stap
▪ Transposase enzyme met dubbele activiteit: knipt en voegt adapters toe
▪ PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adapters
- Size selection
o Doel: gewenste lengte inserts selecteren
o Klassiek: agarose gel-elektroforese: gewenste lengtes uitsnijden en opzuiveren met
alcoholprecipitatie of ionenuitwisselingskolom
o Nieuwere selectie-methodes: magnetische beads binden DNA dat precipiteert owv molecular
crowding (polyethyleenglycol - PEG), PEG concentratie bepaalt precipiteerde lengte
▪ 1-zijdig: korte ongeprecipiteerde fragmenten wegfilteren
▪ 2-zijdig: wegfilteren kleine en grote fragmenten
4
Inhoud
H2: DNA en genomics ............................................................................................................................................3
DNA SEQUENTIEBEPALING ................................................................................................................................3
DNA GENOTYPEREN ........................................................................................................................................12
DNA HYBRIDISEREN .........................................................................................................................................14
H3: RNA en transcriptomics ................................................................................................................................15
RNA MICRO-ARRAYS........................................................................................................................................16
RNA SEQUENCING (bulk) .................................................................................................................................17
SINGLE-CELL RNA SEQUENCING ......................................................................................................................18
SPATIAL TRANSCRIPTOMICS ............................................................................................................................20
H4: Eiwitten en proteomics .................................................................................................................................21
SEQUENTIEANALYSE ........................................................................................................................................21
PROTEOOMANALYSE .......................................................................................................................................22
3D-STRUCTUURBEPALING ...............................................................................................................................24
EIWIT-EIWIT INTERACTIES ...............................................................................................................................28
H5: Metabolieten en lipiden ...............................................................................................................................32
SPECIFIEKE TESTEN VAN INDIVIDUELE METABOLIETEN ..................................................................................32
METABOLOMICS ..............................................................................................................................................32
METABOLE FLUX ANALYSE (Fluxomics) ...........................................................................................................33
ANALYSE VAN LIPIDEN.....................................................................................................................................33
H6: Gentranscriptie .............................................................................................................................................37
NASCENT RNA ANALYSES (ontluikend RNA)....................................................................................................37
PROMOTOR-REPORTER STUDIES ....................................................................................................................39
ANALYSE VAN PROTEIN-DNA INTERACTIES .....................................................................................................39
H7: Data-analyse en databanken ........................................................................................................................42
LITERATUUR.....................................................................................................................................................42
DATA REPOSITORIA .........................................................................................................................................42
DATA PLATFORMEN ........................................................................................................................................42
DATA-ANALYSE ................................................................................................................................................43
1
,H8: Modulatie van genexpressie .........................................................................................................................45
ONDERDRUKKING VAN GENEXPRESSIE VIA ANTISENSE TECHNOLOGIE .........................................................45
GENDISRUPTIE, MUTAGENESE EN EDITING ....................................................................................................47
ECTOPISCHE EXPRESSIE EN OVEREXPRESSIE ...................................................................................................52
GERICHTE PROTEÏNE DEGRADATIE..................................................................................................................53
METHODE VAN GENTRANSFER .......................................................................................................................53
H9: Systeembiologie ............................................................................................................................................56
Synthetische biologie ......................................................................................................................................56
H10: Integreren en oplossen van vraagstellingen ...............................................................................................57
2
,H2: DNA en genomics
DNA SEQUENTIEBEPALING
- De novo genoom sequentiebepaling
o Ongekende genomen (bij allereerste keer)
o Nieuwe organismen, humaan genoom project
o Gedeeltelijk of volledig
- Resequencing
o Individuen tov referentiegenoom
o Verschillen tussen individuen (SNPs)
o Mutaties (ziektes)
o Construct verificatie
o Klinische toepassingen: diagnose, farmacogenetica,
NIPT
- Sequentiebepaling als teller
o Aantallen DNA (of RNA) moleculen
(seq moet gekend zijn)
o Zie RNAseq, ChIPseq
SANGER SEQUENCING = nieuwsynthese met dideoxy-ketenterminatie
- Template = clone of PCR amplicon
- Amplicon + primer + dNTPs + DNApol + ddNTP (fluo)
- Verschillende grootte van reads
- Scheiding strengen op gel of capillair → elektroferogram (eerste 30nt niet afleesbaar)
- Anti-sense reconstrueren → omzetten naar sense
- = beperkt tot 500 nt, moeite met herhalingen
- Voor betrouwbaarheid: twee aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen af te lezen
SHORT-READ NEXT-GENERATION SEQUENCING
➔ Doel: hogere throughput, lagere kost → massale DNA-sequentiebepaling mogelijk
➔ Richtdoel: 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor <1000$
- Parallelle detectie (massive parallel sequencing)
o Cluster of polony = kopien van DNA-template
o Klonale in vitro amplificatie van template → duizend-milj kopieën van DNA-template/cluster
o Multiplexing: vele clusters tegelijk
- Miniaturisatie van reacties
- Integratie van proces: directe detectie
3
, 1. Aanmaak DNA library
Types library:
- Whole genome sequencing
- Mate pair libraries
- Whole exome sequencing of targeted sequencing: door hybridisatie aan probes of PCR-gebaseerd
o WES = whole-exome sequencing
▪ Coderende sequentie (niet UTR)
▪ 1,5% v genoom
o Targeted sequencing = specifiek gewenste regio’s
- Amplicon sequencing: PCR amplicons
- cDNA library (RNAseq)
Procedure aanmaak library:
- Input DNA → kwaliteitscontrole
o Hoeveelheid en concentratie: verschillende methoden
o Zuiverheid, bv spectrofotometrie A260/280 en A260/230 ratio
o Integriteit, bv capillaire electroforese
- Random fragmentatie (sonicatie, nebulisatie, Dnase I,…)
- End repair
o Blunt ends maken (T4 DNA polymerase en Klenow fragment)
o 5’ uiteinde fosforyleren (T4 polynucleotide kinase)
o Eventueel 3’ non-template A aanhechten (Taq polymerase)
- Adapters aanhechten
o Nodig voor PCR en sequencing primers + ev. indices/barcodes (per staal/molecule)
o Ligatie met fragment uiteinden (sticky end met 3’A overhang of blunt-end)
o Eventueel selectie van fragmenten met twee verschillende adaptoren
o Enkele PCR cycli: fragment met adapters amplificeren, high-fidelity polymerasen met min. bias (bv.
GC%)
o Alternatief: tagmentatie: fragmentatie en adapters aanhechten in één stap
▪ Transposase enzyme met dubbele activiteit: knipt en voegt adapters toe
▪ PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adapters
- Size selection
o Doel: gewenste lengte inserts selecteren
o Klassiek: agarose gel-elektroforese: gewenste lengtes uitsnijden en opzuiveren met
alcoholprecipitatie of ionenuitwisselingskolom
o Nieuwere selectie-methodes: magnetische beads binden DNA dat precipiteert owv molecular
crowding (polyethyleenglycol - PEG), PEG concentratie bepaalt precipiteerde lengte
▪ 1-zijdig: korte ongeprecipiteerde fragmenten wegfilteren
▪ 2-zijdig: wegfilteren kleine en grote fragmenten
4
