Hdst 1
Celcultuur zenuwen uit kikkerelementen in lymfe op glasplaatjes werden
gekweekt. Later ontstonden 2D monolaagcultures die 3D organen/weefsels
"simuleren". Echte 3D cultures zijn zeldzaam, behalve bij abnormale celdeling
(tumorcellen) of sferoïdvorming in collageengels.
Oorspronkelijk werden monolaagcultures gevormd uit orgaanexplantaten
(primaire cultures) in Earle's Minimum Essential Medium (EMEM). Later werden
'stabiele' cellijnen ontwikkeld met een potentieel onbeperkte levensduur
(geïmmortaliseerd), vaak van tumorale oorsprong of na een 'crisis' (selectie) van
cultures die anders verouderen en afsterven ('senescence'). Hoewel 'stabiel',
kunnen cellijnen na een aantal passages (splitsen van cellen) toch veranderen.
Immortalisatie kan ook bereikt worden door selectie of de introductie van virale
oncogenen.
Stadia van celcultivering omvatten:
1. Verzameling van een orgaan of tumorstukje.
2. Enzymatische behandeling van het weefsel.
3. Cellen laten uitzakken of centrifugeren naar de bodem.
4. Uitsplaten van cellen in een groeirecipiënt (bijv. petrischaal).
5. Hopelijk overleven de cellen en groeien ze uit.
6. Bij een confluente laag worden cellen losgemaakt en gesplitst.
Typische celculturen zijn vaak monolaagcultures van epitheelcellen, waarbij
kolonies ontstaan uit individuele cellen. Tumorcellen kunnen ook in 3D groeien
(in dense foci) omdat ze het vermogen tot contactinhibitie kunnen hebben
verloren.
Cultuurcondities zijn cruciaal om cellen in vitro vergelijkbaar te houden met
cellen in vivo.
Media: Minimum Essential Medium (MEM) bevat isotonische zouten (zoals
NaHCO3/H2CO3-buffer), een energiebron (glucose), essentiële aminozuren
en vitamines, en bijna altijd serum (een duur natuurproduct met
kwaliteitsvariatie). Andere klassieke celmedia zijn DMEM, M199, McCoy’s,
en RPMI1640. Voorbeelden van groeimedia die in wetenschappelijke
literatuur worden gebruikt zijn Dulbecco's modified Eagle's medium (DME)
met toevoegingen zoals foetaal kalfsserum, L-glutamine, penicilline,
streptomycine, en nerve growth factor.
Atmosfeer: De culturen moeten groeien onder een atmosfeer van 5%
CO2 in lucht (vergelijkbaar met het CO2-gehalte in bloed en
weefselvochten) om een goede pH van 7,4 te behouden.
Temperatuur: Wordt vaak gehandhaafd op 37°C.
,Cultuurrecipiënten omvatten gesloten flessen (voor in warme kamer, CO2
toevoegen alvorens dicht te draaien), open platen (voor in CO2 ovens), en
rollerflessen (voor een groot oppervlak met cellen maar weinig medium).
Oorsprong van cellen in wetenschappelijke literatuur kan variëren: ze kunnen
afkomstig zijn van andere laboratoria, eigen isolatie (primaire culturen), of
celbanken zoals ATCC (The American Type Culture Collection) en ECACC (The
European Collection of Cell Cultures).
Groeisubstraten en -procedures: Het substraat is een fysische drager en
beschermt tegen anoïkis (een vorm van geprogrammeerde celdood). Het is
essentieel voor adherente celcultures (de meeste celtypes, behalve
circulerende bloedcellen of bepaalde tumorcellen).
Materiaal: Glas (negatief geladen), voorbehandeld polystyreen
(microplaten, flessen, rollers, beads).
Coatings: Poly-D-lysine (sterk positief geladen), collageen (eiwit van de
Extra-Cellulaire Matrix = E.C.M.), geconditioneerd milieu (van
moedercultuur), of feeder celcultures (bijv. door irradiatie geïnhibeerd voor
celdeling maar niet voor metabolisme).
Interactie: Kan aspecifiek fysisch zijn (toelaten van cellulaire adhesie
en celspreiding) of specifiek functioneel (differentiatie-inductie door
stimulatie van de basaalmembraan/basale lamina (BM)). In vivo hebben
cellen contact met hun micro-omgeving, zowel fysisch als via secretie van
groeifactoren.
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie: Cellen in cultuur delen totdat ze een
confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Dan treedt
'contactinhibitie' van celproliferatie op, mede door competitie voor mitogenen.
Om de cultuur te behouden, moet deze worden gesplitst door vers medium toe te
voegen, of efficiënter, de cultuur te splitsen in dochterculturen.
De procedure van celtransfer gebeurt:
Bij suspensiecultures: door eenvoudige verdunning na zacht
afcentrifugeren en heropname in vers milieu.
Bij adherente cellen (gemiddeld om de 3 à 7 dagen): door behandeling met
trypsine/EDTA (TE).
o Trypsine: een maagprotease dat bij korte behandeling oppervlakte-
eiwitten van de cellen degradeert.
o EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat): cheleert calcium en
magnesium, wat de intercellulaire adhesie en cel-substraat-binding
verstoort. Onder geschikte condities komen de cellen los van het
substraat en van elkaar, en vormen een suspensie van levende,
opgebolde cellen. De suspensie moet optimaal monocellulair zijn.
Deze wordt dan 1 over 3 ('normale' cellen) tot 1 over 30 ('tumorale'
cellen) verdund en uitgezaaid in nieuwe recipiënten. Resterend
trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren in het serum.
Stappen bij celadhesie en -spreiding na losmaken en uitplaten:
, 1. Cellen zakken uit onder invloed van gravitatie.
2. Initieel contact met het substraat (minimaal adhesieoppervlak).
3. Progressieve spreiding over het substraat (energievraagt,
cytoskeletwijzigingen, vergroting celcontactoppervlak, versterking
adhesie).
4. Sterke binding met het substraat door aanmaak van eigen E.C.M.
moleculen. Cellen kunnen traag over het celoppervlak migreren door
focale, tijdelijke inhibitie van celadhesie op de loskomende plaats en
opbouw van adhesie in de migratierichting.
Speciale apparatuur voor celcultuur omvat:
Laminaire flowbench met steriliserende HEPA filter (High Efficiency
Particulate Air). Er zijn 17 flowbenches in de CTC core op de UZ campus.
CO2 oven met steriliserende HEPA filter.
Stockering van ingevroren cellen in vloeibare stikstof (-196°C) met
antikristallijn cryoprotectief (glycerol, DMSO).
Differentiatie en Stamcellen Differentiatie in vitro is mogelijk, zoals de
transformatie van een myoblast naar een myotube. Een stamcel is een cel die
het vermogen heeft om voortdurend te delen (zelfvernieuwing) en te
differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen/weefsels.
Er zijn verschillende types stamcellen:
Totipotente stamcellen: Hebben de potentie om zich tot een volledige
foetus te ontwikkelen. Dit geldt voor de cellen in de eerste uren na de
bevruchting.
Pluripotente stamcellen: Kunnen zich ontwikkelen tot veel, maar niet
alle, verschillende celtypen. Dit omvat de cellen van de binnenste
celmassa (ICM) in een blastocyst (ongeveer 4 dagen na bevruchting). De
buitenste cellen van de blastocyst differentiëren tot cellen die de placenta
vormen.
Multipotente stamcellen: Zijn meer gespecialiseerd en kunnen zich
ontwikkelen tot verschillende celtypen binnen een specifieke lijn,
bijvoorbeeld hematopoëtische stamcellen die zich kunnen ontwikkelen tot
rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar beperkt zijn tot
bloedcellen.
De aanmaak van muis embryonale stamcellen omvat het cultiveren van de
binnenste celmassa op een feederlaag (levensvatbare, niet-prolifererende
embryonale fibroblasten) met groeifactoren zoals LIF (Leukaemia inhibitory
factor). De cellen kunnen gescheiden (trypsinebehandeling) en opnieuw
uitgezaaid worden over verschillende generaties, en de cellijnen kunnen worden
ingevroren. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn ethisch
minder beladen dan embryonale stamcellen. Organoïden, of 'in vitro organen',
kunnen worden gemaakt uit stamcellen.
, Ethiek van Humaan Embryonaal Stamcelonderzoek: Stamcelonderzoek
biedt inzicht in cel- en ziekteontwikkeling en medicatiewerking. Hoewel men over
het algemeen positief is, zolang het doel niet "een betere mens" maken is, is het
gebruik van embryonale stamcellen controversieel. Embryonale stamcellen
komen uit embryo's uit IVF-trajecten.
Standpunten:
o Een minderheidsstandpunt beschouwt een embryo als een mens in
het klein, waarbij vernietiging voor onderzoek moord is en strikt
onaanvaardbaar.
o Een ander standpunt stelt dat onderzoek alleen mag op
overgebleven embryo's uit IVF-cycli die anders weggegooid
zouden worden, maar het maken van embryo's puur voor onderzoek
is niet toegestaan.
o Het moment van gebruik van het embryo is van belang; hoe
ouder het embryo, hoe meer het als een mens wordt gezien. In
België mag een embryo maximaal 12 dagen oud zijn voor
onderzoek.
Regelgeving: De algemene trend in de westerse onderzoekswereld is dat
stamcelonderzoek met de grootste voorzichtigheid kan plaatsvinden. In
België is stamcelonderzoek onderworpen aan strenge wetten die
voorwaarden stellen aan het doel van het onderzoek, methoden, labo en
zelfs het diploma van de onderzoeker.
Kwaliteitscontrole Celcultures kunnen gecontamineerd raken met:
Micro-organismen: Bacteriën, gisten, schimmels, en vooral antibiotica-
resistente mycoplasma's. Mycoplasma's zijn parasitair, deels
intracellulair, verstoren cellulair metabolisme (vaak door overdreven
verzuring), zijn moeilijk detecteerbaar (cytoplasmatische DNA-kleuring,
ELISA, PCR) en vaak moeilijk elimineerbaar. Effecten van mycoplasma-
contaminatie omvatten veranderingen in eiwit-, RNA- en DNA-synthese,
celmetabolisme, chromosomale aberraties, membraansamenstelling,
morfologie, en proliferatiekenmerken, wat kan leiden tot celveroudering en
-verlies.
Vreemde cellen: Dit komt vaker voor dan gedacht. De helft van de
"oudere" cellijnen zijn varianten van HeLa, een klassieke humane cervix-
tumor cellijn. Vele "menselijke" cellijnen bleken van muis- of
rattenoorsprong te zijn. Detectie van contaminaties is mogelijk via
genetische fingerprinting en karyotypering.
De zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kan gemeten
worden door karyotypering, waarbij het aantal en de vorm van de
chromosomen in individuele cellen worden bepaald. Cellijnen vertonen vaak
inherente genetische instabiliteit, waarbij het genotype van gekweekte
cellen kan evolueren. Dit kan beperkt worden door regelmatig terug te gaan naar
stock-cultures die zijn ingevroren in vloeibare stikstof.
Celcultuur zenuwen uit kikkerelementen in lymfe op glasplaatjes werden
gekweekt. Later ontstonden 2D monolaagcultures die 3D organen/weefsels
"simuleren". Echte 3D cultures zijn zeldzaam, behalve bij abnormale celdeling
(tumorcellen) of sferoïdvorming in collageengels.
Oorspronkelijk werden monolaagcultures gevormd uit orgaanexplantaten
(primaire cultures) in Earle's Minimum Essential Medium (EMEM). Later werden
'stabiele' cellijnen ontwikkeld met een potentieel onbeperkte levensduur
(geïmmortaliseerd), vaak van tumorale oorsprong of na een 'crisis' (selectie) van
cultures die anders verouderen en afsterven ('senescence'). Hoewel 'stabiel',
kunnen cellijnen na een aantal passages (splitsen van cellen) toch veranderen.
Immortalisatie kan ook bereikt worden door selectie of de introductie van virale
oncogenen.
Stadia van celcultivering omvatten:
1. Verzameling van een orgaan of tumorstukje.
2. Enzymatische behandeling van het weefsel.
3. Cellen laten uitzakken of centrifugeren naar de bodem.
4. Uitsplaten van cellen in een groeirecipiënt (bijv. petrischaal).
5. Hopelijk overleven de cellen en groeien ze uit.
6. Bij een confluente laag worden cellen losgemaakt en gesplitst.
Typische celculturen zijn vaak monolaagcultures van epitheelcellen, waarbij
kolonies ontstaan uit individuele cellen. Tumorcellen kunnen ook in 3D groeien
(in dense foci) omdat ze het vermogen tot contactinhibitie kunnen hebben
verloren.
Cultuurcondities zijn cruciaal om cellen in vitro vergelijkbaar te houden met
cellen in vivo.
Media: Minimum Essential Medium (MEM) bevat isotonische zouten (zoals
NaHCO3/H2CO3-buffer), een energiebron (glucose), essentiële aminozuren
en vitamines, en bijna altijd serum (een duur natuurproduct met
kwaliteitsvariatie). Andere klassieke celmedia zijn DMEM, M199, McCoy’s,
en RPMI1640. Voorbeelden van groeimedia die in wetenschappelijke
literatuur worden gebruikt zijn Dulbecco's modified Eagle's medium (DME)
met toevoegingen zoals foetaal kalfsserum, L-glutamine, penicilline,
streptomycine, en nerve growth factor.
Atmosfeer: De culturen moeten groeien onder een atmosfeer van 5%
CO2 in lucht (vergelijkbaar met het CO2-gehalte in bloed en
weefselvochten) om een goede pH van 7,4 te behouden.
Temperatuur: Wordt vaak gehandhaafd op 37°C.
,Cultuurrecipiënten omvatten gesloten flessen (voor in warme kamer, CO2
toevoegen alvorens dicht te draaien), open platen (voor in CO2 ovens), en
rollerflessen (voor een groot oppervlak met cellen maar weinig medium).
Oorsprong van cellen in wetenschappelijke literatuur kan variëren: ze kunnen
afkomstig zijn van andere laboratoria, eigen isolatie (primaire culturen), of
celbanken zoals ATCC (The American Type Culture Collection) en ECACC (The
European Collection of Cell Cultures).
Groeisubstraten en -procedures: Het substraat is een fysische drager en
beschermt tegen anoïkis (een vorm van geprogrammeerde celdood). Het is
essentieel voor adherente celcultures (de meeste celtypes, behalve
circulerende bloedcellen of bepaalde tumorcellen).
Materiaal: Glas (negatief geladen), voorbehandeld polystyreen
(microplaten, flessen, rollers, beads).
Coatings: Poly-D-lysine (sterk positief geladen), collageen (eiwit van de
Extra-Cellulaire Matrix = E.C.M.), geconditioneerd milieu (van
moedercultuur), of feeder celcultures (bijv. door irradiatie geïnhibeerd voor
celdeling maar niet voor metabolisme).
Interactie: Kan aspecifiek fysisch zijn (toelaten van cellulaire adhesie
en celspreiding) of specifiek functioneel (differentiatie-inductie door
stimulatie van de basaalmembraan/basale lamina (BM)). In vivo hebben
cellen contact met hun micro-omgeving, zowel fysisch als via secretie van
groeifactoren.
Celdensiteits-afhankelijke inhibitie: Cellen in cultuur delen totdat ze een
confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Dan treedt
'contactinhibitie' van celproliferatie op, mede door competitie voor mitogenen.
Om de cultuur te behouden, moet deze worden gesplitst door vers medium toe te
voegen, of efficiënter, de cultuur te splitsen in dochterculturen.
De procedure van celtransfer gebeurt:
Bij suspensiecultures: door eenvoudige verdunning na zacht
afcentrifugeren en heropname in vers milieu.
Bij adherente cellen (gemiddeld om de 3 à 7 dagen): door behandeling met
trypsine/EDTA (TE).
o Trypsine: een maagprotease dat bij korte behandeling oppervlakte-
eiwitten van de cellen degradeert.
o EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat): cheleert calcium en
magnesium, wat de intercellulaire adhesie en cel-substraat-binding
verstoort. Onder geschikte condities komen de cellen los van het
substraat en van elkaar, en vormen een suspensie van levende,
opgebolde cellen. De suspensie moet optimaal monocellulair zijn.
Deze wordt dan 1 over 3 ('normale' cellen) tot 1 over 30 ('tumorale'
cellen) verdund en uitgezaaid in nieuwe recipiënten. Resterend
trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren in het serum.
Stappen bij celadhesie en -spreiding na losmaken en uitplaten:
, 1. Cellen zakken uit onder invloed van gravitatie.
2. Initieel contact met het substraat (minimaal adhesieoppervlak).
3. Progressieve spreiding over het substraat (energievraagt,
cytoskeletwijzigingen, vergroting celcontactoppervlak, versterking
adhesie).
4. Sterke binding met het substraat door aanmaak van eigen E.C.M.
moleculen. Cellen kunnen traag over het celoppervlak migreren door
focale, tijdelijke inhibitie van celadhesie op de loskomende plaats en
opbouw van adhesie in de migratierichting.
Speciale apparatuur voor celcultuur omvat:
Laminaire flowbench met steriliserende HEPA filter (High Efficiency
Particulate Air). Er zijn 17 flowbenches in de CTC core op de UZ campus.
CO2 oven met steriliserende HEPA filter.
Stockering van ingevroren cellen in vloeibare stikstof (-196°C) met
antikristallijn cryoprotectief (glycerol, DMSO).
Differentiatie en Stamcellen Differentiatie in vitro is mogelijk, zoals de
transformatie van een myoblast naar een myotube. Een stamcel is een cel die
het vermogen heeft om voortdurend te delen (zelfvernieuwing) en te
differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen/weefsels.
Er zijn verschillende types stamcellen:
Totipotente stamcellen: Hebben de potentie om zich tot een volledige
foetus te ontwikkelen. Dit geldt voor de cellen in de eerste uren na de
bevruchting.
Pluripotente stamcellen: Kunnen zich ontwikkelen tot veel, maar niet
alle, verschillende celtypen. Dit omvat de cellen van de binnenste
celmassa (ICM) in een blastocyst (ongeveer 4 dagen na bevruchting). De
buitenste cellen van de blastocyst differentiëren tot cellen die de placenta
vormen.
Multipotente stamcellen: Zijn meer gespecialiseerd en kunnen zich
ontwikkelen tot verschillende celtypen binnen een specifieke lijn,
bijvoorbeeld hematopoëtische stamcellen die zich kunnen ontwikkelen tot
rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar beperkt zijn tot
bloedcellen.
De aanmaak van muis embryonale stamcellen omvat het cultiveren van de
binnenste celmassa op een feederlaag (levensvatbare, niet-prolifererende
embryonale fibroblasten) met groeifactoren zoals LIF (Leukaemia inhibitory
factor). De cellen kunnen gescheiden (trypsinebehandeling) en opnieuw
uitgezaaid worden over verschillende generaties, en de cellijnen kunnen worden
ingevroren. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn ethisch
minder beladen dan embryonale stamcellen. Organoïden, of 'in vitro organen',
kunnen worden gemaakt uit stamcellen.
, Ethiek van Humaan Embryonaal Stamcelonderzoek: Stamcelonderzoek
biedt inzicht in cel- en ziekteontwikkeling en medicatiewerking. Hoewel men over
het algemeen positief is, zolang het doel niet "een betere mens" maken is, is het
gebruik van embryonale stamcellen controversieel. Embryonale stamcellen
komen uit embryo's uit IVF-trajecten.
Standpunten:
o Een minderheidsstandpunt beschouwt een embryo als een mens in
het klein, waarbij vernietiging voor onderzoek moord is en strikt
onaanvaardbaar.
o Een ander standpunt stelt dat onderzoek alleen mag op
overgebleven embryo's uit IVF-cycli die anders weggegooid
zouden worden, maar het maken van embryo's puur voor onderzoek
is niet toegestaan.
o Het moment van gebruik van het embryo is van belang; hoe
ouder het embryo, hoe meer het als een mens wordt gezien. In
België mag een embryo maximaal 12 dagen oud zijn voor
onderzoek.
Regelgeving: De algemene trend in de westerse onderzoekswereld is dat
stamcelonderzoek met de grootste voorzichtigheid kan plaatsvinden. In
België is stamcelonderzoek onderworpen aan strenge wetten die
voorwaarden stellen aan het doel van het onderzoek, methoden, labo en
zelfs het diploma van de onderzoeker.
Kwaliteitscontrole Celcultures kunnen gecontamineerd raken met:
Micro-organismen: Bacteriën, gisten, schimmels, en vooral antibiotica-
resistente mycoplasma's. Mycoplasma's zijn parasitair, deels
intracellulair, verstoren cellulair metabolisme (vaak door overdreven
verzuring), zijn moeilijk detecteerbaar (cytoplasmatische DNA-kleuring,
ELISA, PCR) en vaak moeilijk elimineerbaar. Effecten van mycoplasma-
contaminatie omvatten veranderingen in eiwit-, RNA- en DNA-synthese,
celmetabolisme, chromosomale aberraties, membraansamenstelling,
morfologie, en proliferatiekenmerken, wat kan leiden tot celveroudering en
-verlies.
Vreemde cellen: Dit komt vaker voor dan gedacht. De helft van de
"oudere" cellijnen zijn varianten van HeLa, een klassieke humane cervix-
tumor cellijn. Vele "menselijke" cellijnen bleken van muis- of
rattenoorsprong te zijn. Detectie van contaminaties is mogelijk via
genetische fingerprinting en karyotypering.
De zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kan gemeten
worden door karyotypering, waarbij het aantal en de vorm van de
chromosomen in individuele cellen worden bepaald. Cellijnen vertonen vaak
inherente genetische instabiliteit, waarbij het genotype van gekweekte
cellen kan evolueren. Dit kan beperkt worden door regelmatig terug te gaan naar
stock-cultures die zijn ingevroren in vloeibare stikstof.
