MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
DEEL I: SITUERING MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
1. WAT ZIJN MOLECULAIRE TESTEN?
Start materiaal: erfelijk materiaal: DNA en RNA van menselijke cellen of micro-organismen
Belangrijkste technieken:
- Hybridisatie: probes à FISH (fluorescent in situ hybridisation)
- Amplificatietechnieken: PCR (polymerase chain reaction)
- Sequencing technieken: Sanger-methode
Soorten testen:
- IVD-kits: in vitro diagnostics, commerciële testen, CE-markering (goedgekeurd vr medische
diagnostiek)
- RUO: research use only, commerciële testen à niet voor medische diagnostiek
- ‘Home-brew’ (in huis) testen
- Volautomaten
Voordelen:
- Hoge gevoeligheid
- Specificiteit
- Snelheid van rapportering
Nadeel: PCR: contaminatie
2. DOMEINEN VAN DE MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
5 grote domeinen:
1. Erfelijke genetische afwijkingen (constitutioneel genetische afwijkingen)
2. Verworven genetische afwijkingen
3. Infectieziekten (microbiologie, virologie, parasitologie)
4. Gerechtelijke geneeskunde
5. Voedselveiligheid
Farmacogenetica:
- Gevoeligheid voor GM
- Metabolisering van GM à neveneffecten
DEEL II: AFWIJKINGEN EN VARIATIES IN HET MENSELIJK GENETISCH MATERIAAL
3. BASIS VAN DE MENSELIJKE ERFELIJKHEID
3.1. MENSELIJK GENETISCH MATERIAAL
3.1.1. EUKARYOTISCH DNA
Genomisch dubbelstrengig DNA met anti parallelle oriëntatie à chromosomen
1
,Euchromatine: geheel of gedeeltelijk ontwonden DNA à genexpressie is mogelijk
Heterochromatine: DNA gecondenseerd tot minimale lengte mbv histonen
à geen genexpressie mogelijk
à alle chromosomen zijn individueel herkenbaar mbv karyotypering (= microscopische analyse vd
metafasechromosomen)
Exonen= 2% v genomisch DNA dat codeert vr EW
Intronen= niet vr EW coderende gebieden (codeert niet voor EW)
3.1.2. CODERENDE VS NIET CODERENDE SEQUENTIES
Grootte humaan genoom: 3,1 Gb
- 3,5% codeert vr EW, ribosomaal RNA (rRNA) en transferRNA (tRNA)
- 94,5% codeert noch vr EW, ribosomaal RNA (rRNA) en transferRNA (tRNA)
- DNA-sequentiemotieven à regulatie v genexpressie à interactie met regulatorEW of hormoon-
receptorcomplexen (vb. promotor)
Gebieden met vergelijkbare kenmerken à geclusterd
- Gen-rijk: hoog gen gehalte
- Gen-arm: laag gen gehalte
ð Afwijking in gen-rijk chromosoom is ernstiger dan defecten v zelfde grootte met gen-arme delen
Repeats= repetitief niet-coderend DNA à meerdere keren aaneengeschakeld of verspreid over genoom
- SSR= simple sequence repeats= microsatellieten= short tandem repeat: 1, 2, 3 of 4 nucleotiden die
10-100x achter elkaar herhaald w à variatie in # repeats is allel-specifiek overervend
Vb. poly-T-stretchesl, satelliet DNA v centromeren en telomeren
- Minisatellieten= VNTR= variable number of tandem repeats: 10-60 nucleotiden op meer dan 1000
plaatsen verspreid over genoom à individuele variatie
- SINE= short interspersed elements: repeats tot 500bp op specifieke posities, verspreid over genoom
Vb. Alu-repeat
- LINE= long interspersed elements: repeats tot 9000bp, 17% v humane genoom à positie en #
verschilt v mens op mens
- Andere DNA-fragmenten:
• Pseudogenen= gedegenereerde genen à functie is verloren gegaan door mutatie à resterende
sequentiemotieven wel nog herkenbaar à fout-positieve gen-expressie-signalen veroorzaken à
geen intronen, wel exonen
• Genfragmenten
• Grote # unieke spacers
3.1.3. SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM
SNP: erfelijk, kenmerkend verschil in nucleotiden op bepaalde positie in genoom à zowel in coderende als
niet-coderende gebieden
Enkele base-substitutie (C à T, C à G, Aà G) in gen à invloed op AZ-volgorde
- Synonymous: basenverandering leidt nt tot ander AZ à SNP in 3e base v triplet code (wobble)
- Non-synonymous: basenverandering leidt tot ander AZ à SNP in 1e of 2e base v triplet code
!Verband tss SNP’s en erfelijke ziekten, gevoeligheid vr GM, aanwezigheid v stofwisselingsziekten
2
, 3.1.4. CPG-EILANDEN
CpG-eilanden= gebieden v min 200 basen met meer dan 50% GC
- Lineaire sequentie met ‘-C-phospate-G-‘
- Vooral in gen promotor gebieden
- 70-80% is gemethyleerd op C5-positie ve pyrimidine à translatie en genexpressie niet mogelijk
3.1.5. ERFELIJKE, AANGEBOREN EN VERWORVEN ZIEKTE VEROORZAKENDE AFWIJKINGEN
Erfelijke afwijkingen= v ouders op kind doorgegeven via geslachtscellen
- Homozygoot mutant: mutatie in duplo
- Heterozygoot mutant: mutatie in enkelvoud
- Familiair: vb. BRCA-gen bij borstkanker
- Ontstaan tijdens vorming vd geslachtscellen of zygote: vb. Downsyndroom à erfelijke, aangeboren
mutatie
Somatische mutaties= mutaties die toevallig nieuw ontstaan tijdens het leven à afwijkende expressiepatronen
Vb.: maligne tumoren
3.1.6. EUKARYOTISCH RNA
RNA= enkelstrengig polynucleotide à in ¹ typen moleculen met eigen functie bij de genexpressie
mRNA:
- 3% vh cellulaire RNA
- 20-40 kb groot
- Poly-A-staart aan 3’-uiteinde en gemethyleerde guanidine aan 5’-uiteinde (cap-structuur)
- Verspreid over cytoplasma in laag kopie #
- Aard en hoeveelheid afh v: celtype, fase in celcyclus, ontwikkelingsstadium, pathologie, reactie op
interne of externe prikkels
- Alternatieve RNA-splicing: ¹ mRNA’s (isovormen) w gevormd uit pre-mRNA à per isovorm w ¹ exonen
aan elkaar gezet à 1 gen kan leiden tot ¹ EW
Vb. calcitonine/CGRP-gen
• Ene isovorm à vorming calcitonine in schildklier
• Ander isovorm à productie CGRP-EW in hypothalamus
Korte niet-coderende RNA’s: < 200 nucleotiden à regulatie vd mRNA niveaus
- miRNA= micro RNA
• 22 nucleotiden
• Op diverse plekken in genoom van sense- en antisense-streng afgelezen
• Regulatie v transcriptie en translatie
• 40% in intronen
- siRNA= small interfering RNA à bindt als complementaire
streng op sleutelpositie v functionele mRNA’s à inactiveren
mRNA
- piRNA’s= PIWIinteracting RNA
Lange niet-coderende RNA’s: > 200 nucleotiden à komen
weefselspecifiek tot expressie à functie onbekend
3
DEEL I: SITUERING MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
1. WAT ZIJN MOLECULAIRE TESTEN?
Start materiaal: erfelijk materiaal: DNA en RNA van menselijke cellen of micro-organismen
Belangrijkste technieken:
- Hybridisatie: probes à FISH (fluorescent in situ hybridisation)
- Amplificatietechnieken: PCR (polymerase chain reaction)
- Sequencing technieken: Sanger-methode
Soorten testen:
- IVD-kits: in vitro diagnostics, commerciële testen, CE-markering (goedgekeurd vr medische
diagnostiek)
- RUO: research use only, commerciële testen à niet voor medische diagnostiek
- ‘Home-brew’ (in huis) testen
- Volautomaten
Voordelen:
- Hoge gevoeligheid
- Specificiteit
- Snelheid van rapportering
Nadeel: PCR: contaminatie
2. DOMEINEN VAN DE MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
5 grote domeinen:
1. Erfelijke genetische afwijkingen (constitutioneel genetische afwijkingen)
2. Verworven genetische afwijkingen
3. Infectieziekten (microbiologie, virologie, parasitologie)
4. Gerechtelijke geneeskunde
5. Voedselveiligheid
Farmacogenetica:
- Gevoeligheid voor GM
- Metabolisering van GM à neveneffecten
DEEL II: AFWIJKINGEN EN VARIATIES IN HET MENSELIJK GENETISCH MATERIAAL
3. BASIS VAN DE MENSELIJKE ERFELIJKHEID
3.1. MENSELIJK GENETISCH MATERIAAL
3.1.1. EUKARYOTISCH DNA
Genomisch dubbelstrengig DNA met anti parallelle oriëntatie à chromosomen
1
,Euchromatine: geheel of gedeeltelijk ontwonden DNA à genexpressie is mogelijk
Heterochromatine: DNA gecondenseerd tot minimale lengte mbv histonen
à geen genexpressie mogelijk
à alle chromosomen zijn individueel herkenbaar mbv karyotypering (= microscopische analyse vd
metafasechromosomen)
Exonen= 2% v genomisch DNA dat codeert vr EW
Intronen= niet vr EW coderende gebieden (codeert niet voor EW)
3.1.2. CODERENDE VS NIET CODERENDE SEQUENTIES
Grootte humaan genoom: 3,1 Gb
- 3,5% codeert vr EW, ribosomaal RNA (rRNA) en transferRNA (tRNA)
- 94,5% codeert noch vr EW, ribosomaal RNA (rRNA) en transferRNA (tRNA)
- DNA-sequentiemotieven à regulatie v genexpressie à interactie met regulatorEW of hormoon-
receptorcomplexen (vb. promotor)
Gebieden met vergelijkbare kenmerken à geclusterd
- Gen-rijk: hoog gen gehalte
- Gen-arm: laag gen gehalte
ð Afwijking in gen-rijk chromosoom is ernstiger dan defecten v zelfde grootte met gen-arme delen
Repeats= repetitief niet-coderend DNA à meerdere keren aaneengeschakeld of verspreid over genoom
- SSR= simple sequence repeats= microsatellieten= short tandem repeat: 1, 2, 3 of 4 nucleotiden die
10-100x achter elkaar herhaald w à variatie in # repeats is allel-specifiek overervend
Vb. poly-T-stretchesl, satelliet DNA v centromeren en telomeren
- Minisatellieten= VNTR= variable number of tandem repeats: 10-60 nucleotiden op meer dan 1000
plaatsen verspreid over genoom à individuele variatie
- SINE= short interspersed elements: repeats tot 500bp op specifieke posities, verspreid over genoom
Vb. Alu-repeat
- LINE= long interspersed elements: repeats tot 9000bp, 17% v humane genoom à positie en #
verschilt v mens op mens
- Andere DNA-fragmenten:
• Pseudogenen= gedegenereerde genen à functie is verloren gegaan door mutatie à resterende
sequentiemotieven wel nog herkenbaar à fout-positieve gen-expressie-signalen veroorzaken à
geen intronen, wel exonen
• Genfragmenten
• Grote # unieke spacers
3.1.3. SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM
SNP: erfelijk, kenmerkend verschil in nucleotiden op bepaalde positie in genoom à zowel in coderende als
niet-coderende gebieden
Enkele base-substitutie (C à T, C à G, Aà G) in gen à invloed op AZ-volgorde
- Synonymous: basenverandering leidt nt tot ander AZ à SNP in 3e base v triplet code (wobble)
- Non-synonymous: basenverandering leidt tot ander AZ à SNP in 1e of 2e base v triplet code
!Verband tss SNP’s en erfelijke ziekten, gevoeligheid vr GM, aanwezigheid v stofwisselingsziekten
2
, 3.1.4. CPG-EILANDEN
CpG-eilanden= gebieden v min 200 basen met meer dan 50% GC
- Lineaire sequentie met ‘-C-phospate-G-‘
- Vooral in gen promotor gebieden
- 70-80% is gemethyleerd op C5-positie ve pyrimidine à translatie en genexpressie niet mogelijk
3.1.5. ERFELIJKE, AANGEBOREN EN VERWORVEN ZIEKTE VEROORZAKENDE AFWIJKINGEN
Erfelijke afwijkingen= v ouders op kind doorgegeven via geslachtscellen
- Homozygoot mutant: mutatie in duplo
- Heterozygoot mutant: mutatie in enkelvoud
- Familiair: vb. BRCA-gen bij borstkanker
- Ontstaan tijdens vorming vd geslachtscellen of zygote: vb. Downsyndroom à erfelijke, aangeboren
mutatie
Somatische mutaties= mutaties die toevallig nieuw ontstaan tijdens het leven à afwijkende expressiepatronen
Vb.: maligne tumoren
3.1.6. EUKARYOTISCH RNA
RNA= enkelstrengig polynucleotide à in ¹ typen moleculen met eigen functie bij de genexpressie
mRNA:
- 3% vh cellulaire RNA
- 20-40 kb groot
- Poly-A-staart aan 3’-uiteinde en gemethyleerde guanidine aan 5’-uiteinde (cap-structuur)
- Verspreid over cytoplasma in laag kopie #
- Aard en hoeveelheid afh v: celtype, fase in celcyclus, ontwikkelingsstadium, pathologie, reactie op
interne of externe prikkels
- Alternatieve RNA-splicing: ¹ mRNA’s (isovormen) w gevormd uit pre-mRNA à per isovorm w ¹ exonen
aan elkaar gezet à 1 gen kan leiden tot ¹ EW
Vb. calcitonine/CGRP-gen
• Ene isovorm à vorming calcitonine in schildklier
• Ander isovorm à productie CGRP-EW in hypothalamus
Korte niet-coderende RNA’s: < 200 nucleotiden à regulatie vd mRNA niveaus
- miRNA= micro RNA
• 22 nucleotiden
• Op diverse plekken in genoom van sense- en antisense-streng afgelezen
• Regulatie v transcriptie en translatie
• 40% in intronen
- siRNA= small interfering RNA à bindt als complementaire
streng op sleutelpositie v functionele mRNA’s à inactiveren
mRNA
- piRNA’s= PIWIinteracting RNA
Lange niet-coderende RNA’s: > 200 nucleotiden à komen
weefselspecifiek tot expressie à functie onbekend
3
