Hoofdstuk 6: Elektrofysiologische metingen
Micropipet
Meettechniek 1: Micropipet
- Zeer dunne glazen pipet
- Celmembraan wordt doorprikt met de micropipet
- Punt van micropipet wordt gemaakt met een pipet puller bij hoge temp
- Werken met een scherpe elektroden om zeker te zijn dat je de kleine cellen goed
perforeert (Membraan)
Pipet Weerstand = Moet zo laag mogelijk zijn om goede metingen te kunnen doen
- De tip wordt opgevuld met hoog geleidende oplossing (KCl)
Het spanningsverschil wordt gemeten tussen de spanning aan de binnenkant van de cel
en een referentie-elektrode aanbrengen in het bad (Referentiewaarde) waarin dat de
cellen zich bevinden
Lek weerstand = Moet zo hoog mogelijk zijn zodanig dat we weinig stroomverlies hebben
aan de rand van de pipet
- Het is de weerstand die in parallel staat met de weerstand van de pipet
Rekening mee houden: Dat de pipet uit glas is gemaakt en dat er een bepaalde lading
opbouw kan gebeuren
, Patch Clamp
Meettechniek 2: Patch Clamp
- Gebruikt een pipet maar de pipet wordt dichter bij de cel gebracht
- Daarna wordt er een onderdruk gecreëerd in de pipet waardoor dat een stuk van
de cel wordt aangezogen
Dit is een eerste configuratie = Cell-Attached Patch Clamp
- Celmembraan blijft intact waarbij het cytosol en membraan onaangetast blijven
- De weerstand van de pipet moet zo laag mogelijk zijn omdat we zo goed mogelijk
de weerstand van de patch willen meten
- R Seal moet zo hoog mogelijk zijn zodanig dat we zo weinig mogelijk stroomverlies
hebben -> De stroompuls gaat niet door deze weerstand gaan
- R pipet moet heel laag zijn
Nadeel: De membraancapaciteit kan niet gemeten worden doordat we geen toegang
krijgen tot de binnenkant van de cel
De stroompuls gaat altijd door de laagste weerstand gaan
Bij patch clamp hebben we toegang tot het inwendige van de cel
1. Configuratie 1: Het stukje van de membraan lostrekken waardoor dat je toegang
krijgt tot het binnenste deel van de membraan = Inside-out
- Daarna kan je spelen met het toevoegen van stoffen en concentratie om de
permeabiliteit van het membraan te beïnvloeden
2. Configuratie 2: De onderdruk verder gaan verhogen (Starten van Cell-Attached
configuratie) waardoor dat het membraan gaat scheuren (Lokaal) en je toegang
krijgt tot de volledige cel (Ook cytosol) = Whole-Cell Patch Clamp
- We gaan de volledige cel meten doordat we toegang hebben tot de binnenkant
van de cel
Micropipet
Meettechniek 1: Micropipet
- Zeer dunne glazen pipet
- Celmembraan wordt doorprikt met de micropipet
- Punt van micropipet wordt gemaakt met een pipet puller bij hoge temp
- Werken met een scherpe elektroden om zeker te zijn dat je de kleine cellen goed
perforeert (Membraan)
Pipet Weerstand = Moet zo laag mogelijk zijn om goede metingen te kunnen doen
- De tip wordt opgevuld met hoog geleidende oplossing (KCl)
Het spanningsverschil wordt gemeten tussen de spanning aan de binnenkant van de cel
en een referentie-elektrode aanbrengen in het bad (Referentiewaarde) waarin dat de
cellen zich bevinden
Lek weerstand = Moet zo hoog mogelijk zijn zodanig dat we weinig stroomverlies hebben
aan de rand van de pipet
- Het is de weerstand die in parallel staat met de weerstand van de pipet
Rekening mee houden: Dat de pipet uit glas is gemaakt en dat er een bepaalde lading
opbouw kan gebeuren
, Patch Clamp
Meettechniek 2: Patch Clamp
- Gebruikt een pipet maar de pipet wordt dichter bij de cel gebracht
- Daarna wordt er een onderdruk gecreëerd in de pipet waardoor dat een stuk van
de cel wordt aangezogen
Dit is een eerste configuratie = Cell-Attached Patch Clamp
- Celmembraan blijft intact waarbij het cytosol en membraan onaangetast blijven
- De weerstand van de pipet moet zo laag mogelijk zijn omdat we zo goed mogelijk
de weerstand van de patch willen meten
- R Seal moet zo hoog mogelijk zijn zodanig dat we zo weinig mogelijk stroomverlies
hebben -> De stroompuls gaat niet door deze weerstand gaan
- R pipet moet heel laag zijn
Nadeel: De membraancapaciteit kan niet gemeten worden doordat we geen toegang
krijgen tot de binnenkant van de cel
De stroompuls gaat altijd door de laagste weerstand gaan
Bij patch clamp hebben we toegang tot het inwendige van de cel
1. Configuratie 1: Het stukje van de membraan lostrekken waardoor dat je toegang
krijgt tot het binnenste deel van de membraan = Inside-out
- Daarna kan je spelen met het toevoegen van stoffen en concentratie om de
permeabiliteit van het membraan te beïnvloeden
2. Configuratie 2: De onderdruk verder gaan verhogen (Starten van Cell-Attached
configuratie) waardoor dat het membraan gaat scheuren (Lokaal) en je toegang
krijgt tot de volledige cel (Ook cytosol) = Whole-Cell Patch Clamp
- We gaan de volledige cel meten doordat we toegang hebben tot de binnenkant
van de cel
