Moleculaire celbiologie
H9 Visualizing Cells and Molecules
1.1 Inleiding
Microscopie is belangrijk om naar subcellulaire structuren te kijken en hiervoor hebben we 3 soorten microscopie:
1. Lichtmicroscoop: visualisatie tot 200 nm
2. Elektronenmicroscoop: visualisatie tot 0,1 nm
3. Fluorescentiemicroscopie
M.b.v. technische ingrepen (software/algoritmes) kunnen deze limieten verlegt worden
De opbouw v/e standaard lichtmicroscoop ziet er als volgt uit
Vergroting wordt bepaald door
- Tafel: hierop leg je het preparaat de vergroting van het oculair en
- Het oculair: optische lens het objectief
- Het objectief: optische lens
o Verzamelt een kegel van lichtstralen om een beeld te vormen
- Lichtbron + condensorlens: gaat licht capteren om doorheen het preparaat te stralen
o Condensorlens richt een kegel van lichtstralen op elk punt v/h monster
Gewoon wit licht zal de volgende beperkingen hebben:
Verstrooid licht zal mekaar gaan elkaar uitdoven, waardoor je diffractiepatronen gaat
waarnemen
o Elke frequentie wordt anders afgebogen → GEVOLG: lichtgolven gaan met elkaar
interfereren → kunnen elkaar versterken of te niet doen
Glazen lenzen gaan licht breken, wat verstrooid licht zal gaan bevorderen
Dit zal ertoe leiden dat wanneer 2 cellen naast elkaar gelegen zijn, dat deze hoogst waarschijnlijk als 1 cel zullen
worden waargenomen → DUS diffractiepatronen zorgen dat we niet tot oneindig kunnen vergroten
De resolutie (= de minimale details te onderscheiden afhankelijk v/d objectief lens en de breedte v/d doorgaande
0,61∗ 𝜆
lichtbundel) v/e microscoop zal bepaald worden a.d.h.v. de volgende formule: 𝛿 = 𝑁𝐴
- δ = de resolutie
- λ = de golflengte
- NA = numerieke apertuur (hoe groter NA, hoe beter de resolutie)
De NA beschrijft het lichtverzamelend vermogen v/e microscoop en bepaalt hoe goed een objectief kleine details
kan onderscheiden
De waarde voor NA kan als volgt bepaald worden: 𝑁𝐴 = 𝑛 ∗ 𝑠𝑖𝑛𝜃
- n = de refractaire index v/h medium (lucht = 1)
- sinθ = de invallende hoek v/h licht
Voor droge lenzen kan de NA niet groter zijn dan 1 (waarde van lucht)
Voor olie-immersielenzen kan dit wel 1,4 zijn
Hoe hoger de numerieke apertuur, hoe hoger de resolutie en en hoe helderder het beeld
1
,De limieten v/d microscopische revolutie
Met conventionele lichtmicroscopie kunnen we alleen 2 structuren co-lokaliseren binnen de straal v/h luchtige
schijfpatroon dat het optische systeem kan oplossen
Met een zeer goede microscoop is de minimale oplossingsafstand:
- Laterale resolutie: ongeveer 200-250 nm
- Axiale resolutie: minstens 500 nm
Wat niet voldoende is om moleculaire interactie te indiceren
Het lichtmicroscopisch beeld: variatie brengen in beeld
1. Gebruik van kleurstoffen
a. Kleuren niet aanwezig in het specimen worden geabsorbeerd
b. Kleuren aanwezig in het specimen worden doorgelaten
2. Gebruik van schuin invallend licht
a. Afhankelijk v/d hoek waarop het licht invalt, zal het anders verstrooid worden → geeft steeds een
ander beeld
b. Enkel verstrooide lichtstralen zullen het objectief betreden
3. Gebruik van contrast
a. Afhankelijk v/d samenstelling v/h specimen zal het licht op bepaalde plaatsen meer of minder worden
afgebogen (viskeus vs. waterig)
b. Golven in fase voor doorgang door het specimen kunnen uit fase erna → geeft contrast
Verkrijgen van verschillende informatie door variatie van de verschillende parameters:
A) Bright-field: licht gaat rechtstreeks door specimen
B) Fase contrast: verschillen in de fase v/d lichtgolven
C) Normarski differentiaal interferentie (DIC): 2 verschillende lichtstralen door monster
→ worden dan gecombineerd
D) Dark-field: licht schuin op monster zodat enkel het licht verstrooid door het monster
op het oog valt
Fixatie/embedding/sectionering/chemische kleuring
Een andere methode om bepaalde cellen te visualiseren is het aankleuren v/d cellen met
specifieke kleurstoffen. Belangrijk hierbij is dat het weefsel heel dun is, zodanig dat het licht
hierdoor kan passeren.
Kleuring wordt vaak gecombineerd met parafine fixatie: stabiliseert de weefselstructuren en voorkomt afbraak door
enzymen en bacteriën
2
,Kunnen ook invriezen en dan krijgen we cryo secties: kunnen hier meer native structuren detecteren
1.2 Fluorescentiemicroscopie
Immunofluorescentie: eiwitten specifiek kleuren
Voorbeeld van toepassing immunofluorescentie: weten waar een mutant tot expressie komt →onder-,
overexpressie, geen expressie?
Koppeling van fluorescentie merker: tweestaps reactie
1. Antigen A of eiwit A wordt gebonden door het primaire antilichaam
a. Konijn AB gericht tegen AG A
2. Primaire antilichaam wordt gebonden door het secundaire antilichaam
a. Merker gekoppelde Anti-konijn AB gericht tegen Konijn AB
Verklaring gebruik tweestaps reactie voor labeling:
Amplificatie v/h lichtsignaal
Bredere inzet: de prijs drukken
o Specifiek gelabelde antilichamen kosten veel meer dan antilichamen alleen
o Gebruik van primaire niet-getagde antilichamen specifiek voor het antigen
o Gebruik van slechts één soort wel getagd secundair antilichaam, met lage specificiteit
Het fluorescentieproces
Drie fasen van fluorescentie:
1. Excitatie door invallend licht (vaak een laserstraal)
2. Duur van verblijf in de geëxciteerde status: elektronen naar een hoger orbitaal
3. Emissie van golflengte met lagere energie (langere golflengte), na terugval naar
grondtoestand
Komt enkel voor bij bepaalde moleculen (polyaromaten) = fluoroforen of fluorochromen
Fluorescente probes
Fluorescente probe = een aangepast fluorochroom, dat toelaat structuren of functies in cellen (gefixeerd of levend)
te analyseren
Voorbeelden van toepassingen:
▪ (Subcellulaire) localisering v/e specifiek eiwit of organel in een welbepaalde regio van een biologisch staal
(weefsel, cellen in cultuur)
▪ Detectie & opvolging van biologische/biochemische processen doordat het fluorochroom-dragend eiwit
reageert op het toevoegen van een stimulus of een veranderende micro-omgeving (bv. celdelingsproces,
zuurtegraadvergadering in lysosomen, cytoplasmatische calciumverhoging)
3
, Fluorescentie: principe & microscopie
Werking en proces fluorescentiemicroscoop:
1. Na toediening v/e fluorofoor met een excitatiegolflengte van blauw licht en een emissie golflengte van groen
licht aan het specimen, onderzoeken onder de microscoop
a. Belang! Verschil in emissie en excitatie golflengte
2. Eerste barrière filter: laat enkel toe vanuit de lichtbron met wit licht (horizontaal gericht) blauw licht door te
laten
3. Beam splitting mirror, straalsplitsende spiegel:
a. Reflecteer blauw licht → op specimen
b. Transmitteert groen licht → naar het oogstuk
4. Blauw licht valt in op het specimen, fluoroforen emmiteren groen licht dat
doorheen de halfdoorlatende spiegel gaat
5. Tweede barrière filter: laat ongewenste fluorescente signalen weg
Indien we meerdere eiwitten willen waarnemen:
▪ Gebruik van meerdere fluoroforen en afwisselend excitatielaser laten
doorkomen en beelden opnemen
▪ Verschillende opgenomen beelden samenvoegen tot 1 geheel
Green fluorescent protein, GFP
Nadeel van fluorescentiemicroscopie: cellen zijn gefixeerd, niet meer levend, dus geen dynamische
systemen, geen tijdskinetiek meer
OPLOSSING: ontdekking v/e auto-fluorescerende moleculen in kwallen, “green fluorescent
protein”
Gebruik: bv. het waarnemen van tubuline in een levende cel
▪ Tubuline DNA fusioneren met cDNA van GFP waardoor tubuline automatisch begint te
fluoresceren
▪ Voordeel: cellen moeten niet gefixeerd zijn en kunnen blijven groeien + blijven dynamisch
▪ Bv. studie van celdeling en celcyclus
Varianten: na puntmutatie v/h cDNA van bepaald AZ van GFP → verkrijgen van andere kleuren
▪ Gehele kleurenspectrum is nu gevormd door puntmutaties GFP waardoor meerdere structuren tegelijk
kunnen geobserveerd worden o.a. RFP (red), YFP (yellow) …
▪ Selecteer juiste kleurfiltercombinatie voor detectie van colocalisatie van eiwitten met verschillende
fluorescentiemerkers
▪ Belang! emissiegolflengten mogen niet te dicht bij elkaar liggen, anders verkrijgen we een diffuus beeld
waardoor beeldkwaliteit vermindert
Conclusie: GFP: compact, stabiel & universeel label voor markeren & volgen van proteïnes
Fluorescentiemicroscopie in de praktijk
Gebruik van meerdere fluoroforen en meerdere microscopische opnames + beelden samenvoegen
Voorbeeld: aankleuren van kern met DAPI en twee eiwitten met fluoroforen alexa 488 (groen) en 594 (rood)
4
H9 Visualizing Cells and Molecules
1.1 Inleiding
Microscopie is belangrijk om naar subcellulaire structuren te kijken en hiervoor hebben we 3 soorten microscopie:
1. Lichtmicroscoop: visualisatie tot 200 nm
2. Elektronenmicroscoop: visualisatie tot 0,1 nm
3. Fluorescentiemicroscopie
M.b.v. technische ingrepen (software/algoritmes) kunnen deze limieten verlegt worden
De opbouw v/e standaard lichtmicroscoop ziet er als volgt uit
Vergroting wordt bepaald door
- Tafel: hierop leg je het preparaat de vergroting van het oculair en
- Het oculair: optische lens het objectief
- Het objectief: optische lens
o Verzamelt een kegel van lichtstralen om een beeld te vormen
- Lichtbron + condensorlens: gaat licht capteren om doorheen het preparaat te stralen
o Condensorlens richt een kegel van lichtstralen op elk punt v/h monster
Gewoon wit licht zal de volgende beperkingen hebben:
Verstrooid licht zal mekaar gaan elkaar uitdoven, waardoor je diffractiepatronen gaat
waarnemen
o Elke frequentie wordt anders afgebogen → GEVOLG: lichtgolven gaan met elkaar
interfereren → kunnen elkaar versterken of te niet doen
Glazen lenzen gaan licht breken, wat verstrooid licht zal gaan bevorderen
Dit zal ertoe leiden dat wanneer 2 cellen naast elkaar gelegen zijn, dat deze hoogst waarschijnlijk als 1 cel zullen
worden waargenomen → DUS diffractiepatronen zorgen dat we niet tot oneindig kunnen vergroten
De resolutie (= de minimale details te onderscheiden afhankelijk v/d objectief lens en de breedte v/d doorgaande
0,61∗ 𝜆
lichtbundel) v/e microscoop zal bepaald worden a.d.h.v. de volgende formule: 𝛿 = 𝑁𝐴
- δ = de resolutie
- λ = de golflengte
- NA = numerieke apertuur (hoe groter NA, hoe beter de resolutie)
De NA beschrijft het lichtverzamelend vermogen v/e microscoop en bepaalt hoe goed een objectief kleine details
kan onderscheiden
De waarde voor NA kan als volgt bepaald worden: 𝑁𝐴 = 𝑛 ∗ 𝑠𝑖𝑛𝜃
- n = de refractaire index v/h medium (lucht = 1)
- sinθ = de invallende hoek v/h licht
Voor droge lenzen kan de NA niet groter zijn dan 1 (waarde van lucht)
Voor olie-immersielenzen kan dit wel 1,4 zijn
Hoe hoger de numerieke apertuur, hoe hoger de resolutie en en hoe helderder het beeld
1
,De limieten v/d microscopische revolutie
Met conventionele lichtmicroscopie kunnen we alleen 2 structuren co-lokaliseren binnen de straal v/h luchtige
schijfpatroon dat het optische systeem kan oplossen
Met een zeer goede microscoop is de minimale oplossingsafstand:
- Laterale resolutie: ongeveer 200-250 nm
- Axiale resolutie: minstens 500 nm
Wat niet voldoende is om moleculaire interactie te indiceren
Het lichtmicroscopisch beeld: variatie brengen in beeld
1. Gebruik van kleurstoffen
a. Kleuren niet aanwezig in het specimen worden geabsorbeerd
b. Kleuren aanwezig in het specimen worden doorgelaten
2. Gebruik van schuin invallend licht
a. Afhankelijk v/d hoek waarop het licht invalt, zal het anders verstrooid worden → geeft steeds een
ander beeld
b. Enkel verstrooide lichtstralen zullen het objectief betreden
3. Gebruik van contrast
a. Afhankelijk v/d samenstelling v/h specimen zal het licht op bepaalde plaatsen meer of minder worden
afgebogen (viskeus vs. waterig)
b. Golven in fase voor doorgang door het specimen kunnen uit fase erna → geeft contrast
Verkrijgen van verschillende informatie door variatie van de verschillende parameters:
A) Bright-field: licht gaat rechtstreeks door specimen
B) Fase contrast: verschillen in de fase v/d lichtgolven
C) Normarski differentiaal interferentie (DIC): 2 verschillende lichtstralen door monster
→ worden dan gecombineerd
D) Dark-field: licht schuin op monster zodat enkel het licht verstrooid door het monster
op het oog valt
Fixatie/embedding/sectionering/chemische kleuring
Een andere methode om bepaalde cellen te visualiseren is het aankleuren v/d cellen met
specifieke kleurstoffen. Belangrijk hierbij is dat het weefsel heel dun is, zodanig dat het licht
hierdoor kan passeren.
Kleuring wordt vaak gecombineerd met parafine fixatie: stabiliseert de weefselstructuren en voorkomt afbraak door
enzymen en bacteriën
2
,Kunnen ook invriezen en dan krijgen we cryo secties: kunnen hier meer native structuren detecteren
1.2 Fluorescentiemicroscopie
Immunofluorescentie: eiwitten specifiek kleuren
Voorbeeld van toepassing immunofluorescentie: weten waar een mutant tot expressie komt →onder-,
overexpressie, geen expressie?
Koppeling van fluorescentie merker: tweestaps reactie
1. Antigen A of eiwit A wordt gebonden door het primaire antilichaam
a. Konijn AB gericht tegen AG A
2. Primaire antilichaam wordt gebonden door het secundaire antilichaam
a. Merker gekoppelde Anti-konijn AB gericht tegen Konijn AB
Verklaring gebruik tweestaps reactie voor labeling:
Amplificatie v/h lichtsignaal
Bredere inzet: de prijs drukken
o Specifiek gelabelde antilichamen kosten veel meer dan antilichamen alleen
o Gebruik van primaire niet-getagde antilichamen specifiek voor het antigen
o Gebruik van slechts één soort wel getagd secundair antilichaam, met lage specificiteit
Het fluorescentieproces
Drie fasen van fluorescentie:
1. Excitatie door invallend licht (vaak een laserstraal)
2. Duur van verblijf in de geëxciteerde status: elektronen naar een hoger orbitaal
3. Emissie van golflengte met lagere energie (langere golflengte), na terugval naar
grondtoestand
Komt enkel voor bij bepaalde moleculen (polyaromaten) = fluoroforen of fluorochromen
Fluorescente probes
Fluorescente probe = een aangepast fluorochroom, dat toelaat structuren of functies in cellen (gefixeerd of levend)
te analyseren
Voorbeelden van toepassingen:
▪ (Subcellulaire) localisering v/e specifiek eiwit of organel in een welbepaalde regio van een biologisch staal
(weefsel, cellen in cultuur)
▪ Detectie & opvolging van biologische/biochemische processen doordat het fluorochroom-dragend eiwit
reageert op het toevoegen van een stimulus of een veranderende micro-omgeving (bv. celdelingsproces,
zuurtegraadvergadering in lysosomen, cytoplasmatische calciumverhoging)
3
, Fluorescentie: principe & microscopie
Werking en proces fluorescentiemicroscoop:
1. Na toediening v/e fluorofoor met een excitatiegolflengte van blauw licht en een emissie golflengte van groen
licht aan het specimen, onderzoeken onder de microscoop
a. Belang! Verschil in emissie en excitatie golflengte
2. Eerste barrière filter: laat enkel toe vanuit de lichtbron met wit licht (horizontaal gericht) blauw licht door te
laten
3. Beam splitting mirror, straalsplitsende spiegel:
a. Reflecteer blauw licht → op specimen
b. Transmitteert groen licht → naar het oogstuk
4. Blauw licht valt in op het specimen, fluoroforen emmiteren groen licht dat
doorheen de halfdoorlatende spiegel gaat
5. Tweede barrière filter: laat ongewenste fluorescente signalen weg
Indien we meerdere eiwitten willen waarnemen:
▪ Gebruik van meerdere fluoroforen en afwisselend excitatielaser laten
doorkomen en beelden opnemen
▪ Verschillende opgenomen beelden samenvoegen tot 1 geheel
Green fluorescent protein, GFP
Nadeel van fluorescentiemicroscopie: cellen zijn gefixeerd, niet meer levend, dus geen dynamische
systemen, geen tijdskinetiek meer
OPLOSSING: ontdekking v/e auto-fluorescerende moleculen in kwallen, “green fluorescent
protein”
Gebruik: bv. het waarnemen van tubuline in een levende cel
▪ Tubuline DNA fusioneren met cDNA van GFP waardoor tubuline automatisch begint te
fluoresceren
▪ Voordeel: cellen moeten niet gefixeerd zijn en kunnen blijven groeien + blijven dynamisch
▪ Bv. studie van celdeling en celcyclus
Varianten: na puntmutatie v/h cDNA van bepaald AZ van GFP → verkrijgen van andere kleuren
▪ Gehele kleurenspectrum is nu gevormd door puntmutaties GFP waardoor meerdere structuren tegelijk
kunnen geobserveerd worden o.a. RFP (red), YFP (yellow) …
▪ Selecteer juiste kleurfiltercombinatie voor detectie van colocalisatie van eiwitten met verschillende
fluorescentiemerkers
▪ Belang! emissiegolflengten mogen niet te dicht bij elkaar liggen, anders verkrijgen we een diffuus beeld
waardoor beeldkwaliteit vermindert
Conclusie: GFP: compact, stabiel & universeel label voor markeren & volgen van proteïnes
Fluorescentiemicroscopie in de praktijk
Gebruik van meerdere fluoroforen en meerdere microscopische opnames + beelden samenvoegen
Voorbeeld: aankleuren van kern met DAPI en twee eiwitten met fluoroforen alexa 488 (groen) en 594 (rood)
4
