= examenvraag
Biochemische technieken
Deel 3: Chromatografie
Inhoudsopgave
1 Chromatografie ......................................................................................................................... 3
1.1 Inleiding ..................................................................................................................................... 3
1.2 Begrippen en formules ................................................................................................................ 3
1.2.1 Begrippen ............................................................................................................................. 3
1.2.2 Formules .............................................................................................................................. 3
1.3 Oplossend vermogen van een kolom ........................................................................................... 4
1.3.1 Invloed van kolom ................................................................................................................. 4
1.3.2 Invloed van het fasensysteem ................................................................................................ 5
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’ ........................................................................................................ 5
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor a ........................................................................... 5
1.3.3 Invloed van k’, a en N op de resolutie R .................................................................................. 5
1.4 Indeling chromatografie .............................................................................................................. 6
1.5 Apparatuur ................................................................................................................................. 6
1.5.1 Basisopstelling LPC............................................................................................................... 6
1.6 Matrixmateriaal .......................................................................................................................... 6
2 Gelfiltratiechromatografie.......................................................................................................... 7
2.1 Principe ...................................................................................................................................... 7
2.2 Samenstelling van de gelkorrels .................................................................................................. 7
2.3 Zwellen van de gelkorrels ............................................................................................................ 7
2.4 Verwijderen van lucht .................................................................................................................. 7
2.5 Kwantitatieve benadering ............................................................................................................ 8
2.5.1 Samenstelling van het kolomvolume ...................................................................................... 8
2.5.2 Elutievolume ......................................................................................................................... 8
2.6 Fractioneringsbereik ................................................................................................................... 8
2.7 Oplossend vermogen .................................................................................................................. 9
2.7.1 Poriënvolume ........................................................................................................................ 9
2.7.2 Korreldiameter ...................................................................................................................... 9
2.7.3 Bepaling van elutievolume ..................................................................................................... 9
2.8 Toepassingen ............................................................................................................................. 9
2.8.1 Scheiding van groepen moleculen .......................................................................................... 9
2.8.2 Fractionering....................................................................................................................... 10
1
,3 Ionenchromatografie ................................................................................................................ 10
3.1 Inleiding ................................................................................................................................... 10
3.2 Elektrostatische aantrekking ..................................................................................................... 10
3.3 Ionenuitwisseling ...................................................................................................................... 11
3.3.1 Associatieconstante KA,B ...................................................................................................... 11
3.3.2 Selectiviteitsconstante ........................................................................................................ 11
3.4 Ionenuitwisselaars .................................................................................................................... 11
3.4.1 De matrix ............................................................................................................................ 11
3.4.2 Soorten ionogene groepen ................................................................................................... 11
3.4.2.1 Kationenuitwisselaar .................................................................................................... 11
3.4.2.2 Anionenuitwisselaar ..................................................................................................... 12
3.4.2.3 Complexvormende ionenuitwisselaars .......................................................................... 12
3.4.3 Spacer arms ....................................................................................................................... 12
3.4.4 Capaciteit ........................................................................................................................... 13
3.4.5 Toepassingen van eenvoudige ionenuitwisseling .................................................................. 13
3.5 Ionenchromatografie ................................................................................................................ 13
3.5.1 Ionenchromatografie van kleine ionen .................................................................................. 13
3.5.2 Ionenchromatografie van grote ionen ................................................................................... 13
3.5.3 Praktische uitvoering van ionenchromatografie .................................................................... 14
3.5.3.1 Keuze van ionenuitwisselaar ......................................................................................... 14
3.5.3.2 Elutie............................................................................................................................ 15
4 Affiniteitschromatografie .......................................................................................................... 16
4.1 Principe .................................................................................................................................... 16
4.2 Matrix ....................................................................................................................................... 16
4.2.1 Eisen .................................................................................................................................. 16
4.2.2 Soorten gels ........................................................................................................................ 17
4.2.2.1 Geactiveerde gels: ........................................................................................................ 17
4.2.2.2 Ready-to-use gels ......................................................................................................... 17
4.3 Elutie........................................................................................................................................ 18
5 Hydrofobe interactiechromatografie (HIC) ................................................................................. 18
5.1 Principe .................................................................................................................................... 18
5.2 Uitvoering ................................................................................................................................. 18
2
,1 Chromatografie
1.1 Inleiding
> Standaard vloeistofchromatografie = LPC
» Gewerkt met grote korrels, grote kolommen en lage druk (peristatisch pompje)
» Voordeel: voor preparatieve bereidingen + grote monsters
» Nadeel: tijdrovend en beperkte resolutie
» Biomoleculen om te scheiden (EW of NZ)
> Fast performance liquid chromatografie = FPLC
1.2 Begrippen en formules
1.2.1 Begrippen
Begrip Definitie
Retentietijd tR Tijd tussen opbrengen van staal en piekmaximum
Tijd die solvent nodig heeft om door kolom te
Dode tijd to
migreren
Tijd tussen verschijnen van piekmaximum en de
Netto retentietijd t’R
solventpiek
HETP Hoogte equivalent met theoretische plaat
Verwijderen van product van kolom door
Elutie
oplossing in eluens
Eluaat Eluens dat uit kolom komt
Solventreeks gerangschik volgens stijgende
Elutrope reeks
eluerende kracht
Flow rate Snelheid waarmee mobiele fase door kolom gaat
Sedimentatie Gesuspendeerde deeltjes die uitzakken
Reversed phase Stationaire fase lagere polariteit dan mobiele fase
Resolutiefactor R Maat voor de scheidingscapaciteit van de kolom
Verhouding van concentraties in de stationaire en
Verdelingscoëfficiënt K
mobiele fase
Verhouding van hoeveelheden in stationaire en
Capaciteitsfactor k’
mobiele fase
Permeabiliteit Kp Invloed van de pakking op de lineaire snelheid
1.2.2 Formules
> Schotelgetal: bepaalt efficiëntie van kolom en slaat op 1 component
$, $,
N = 16.[ )
] 2 = 5,55 [ )'/! ] 2
. . )
HETP = / = '0 [ $% ] 2
!∗($ ! %!&$ ! %') R = 1: W1+W2 = 2*(tR1-tR2)
> Resolutie = R = )'*)! R < 1: overlap tussen pieken
R > 1: goede scheiding
> Lineaire snelheid
.
𝜇 = $1 23454462478 931:3;4;$ 7; 13<7464 =>?4
𝜈= $3$>64 23454462478 931:3;4;$
𝜈 = $%
. = fractie in mobiele fase * µ
3
, @?
> Verdelingscoëffciënt K = @1
@?∗A? A?
> Capaciteitsfactor k’ k’ = =K*
@1∗A1 A1
> Retentiefactor Rf B $D
Rf = =
C $%
$ ! %!
> Relatieve retentie = selectiviteitsfactor (bepaalt efficiëntie van fasensysteem) 𝛼 = $ !%'
>
> Pieksymmetrie T = < (met a > b )
!∗#∗$
> Permeabiliteit Kp = 1atm = 760mmHg = 1013 mbar = 101,3 kPa = 14,7 psi
%
1.3 Oplossend vermogen van een kolom
> Bepaald door efficiëntie van kolom en fasensysteem
> Goed resultaat: a en N zijn groot
1.3.1 Invloed van kolom
> Van Deemtervergelijking:
!
H = A + + C*µ
"
Onvolledige
Eddy diffusie Longitudale
evenwichtsinstelling
diffusie
H = HETP
@E
H = A + B’ * T + µ = lineaire elutiesnelheid
F
T = temperatuur
> Te lage snelheid: te veel diffusie
> Te hoge snelheid: onvoldoende uitwisseling tussen de 2 delen
4
,Eddy-diffusie
> A = 2*l*dP
> (l = stapelingsfactor en dP = diameter korrels)
> Als korrels verschillend zijn van grootte en 2 dezelfde moleculen gaan door kolom
> Gelijke moleculen volgen niet allemaal zelfde weg à krijgen verschillende snelheid (oranje en
roze lijnen)
> Verschillende verblijftijd in kolom geeft bredere of smallere pieken
> Diameter van korrels geeft verschillende vormen
> Goede kolom heeft beads met gelijke grootte en ook kleine beads
Longitudinale diffusie
> B = 2*Q*Dm (niet bolvormige deeltjes)
G.F G.F
> Met D = =
= 0∗I∗J∗% (bolvormige deeltjes)
> Draagt ook bij tot de zoneverbreding
> Hoe minder lang component in mobiele fase, hoe minder verbreding
Evenwichtsinstelling
GE 8= " GE 8:"
> C = C’S * ('*G !)" + Cm’[ '*GE ] 2 * K1
K?
> Weerstand tegen stofoverdracht
> Te grote elutiesnelheid geeft onvolledige evenwichtsinstelling en dus piekverbreding (willen C zo
laag mogelijk)
1.3.2 Invloed van het fasensysteem
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’
> Maat voor de vertraging van een component door de stationaire fase @?∗A? A?
k’ = @1∗A1 = K * A1
> Kenmerken:
» Afhankelijk van temperatuur
.(G ! *')
» Onafhankelijk van kolomlengte en elutiesnelheid tR = C
» Afhankelijk van contactoppervlak met stationaire
» Afhankelijk van polariteit van mobiele fase
» Beïnvloedt de retentietijd
» Ideale waarden liggen tussen 1 en 5
» Hoe groter k’ hoe groter de scheidingstijd en omgekeerd
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor a
> Maat voor de selectiviteit van fasensysteem
$ ! %! GE!
𝛼= 𝛼 = GE'
$ ! %'
1.3.3 Invloed van k’, a en N op de resolutie R
> Bij R = 1,0 overlappen pieken elkaar voor 2%, componenten zijn 98% gescheiden
> Bij R = 1,5 is de overlapping maar 0,3%, de componenten zijn 99,7% gescheiden
5
, > Bij R = 0,5 is de scheiding nog zeer onvolledig
> Indien R < 1 dan kan men de resolutie verhogen door een van de 3 factoren te verhogen
> Invloed schotelgetal: smalle of brede pieken
> Invloed capaciteitsfactor: maat voor vertraging van de stationaire fase
> Invloed relatieve retentie: afstand tussen pieken
> Invloed op resolutie: als we N met factor 4 verhogen, zal resolutie verhogen met
factor 2
a -1 k' 1 L
R= . ' 2 .
a k2 + 1 4 H
> Invloed op retentietijd: als resolutie x2 verhoogd zal retentietijd x4 verhogen (bij
behoud vd elutiesnelheid)
1.4 Indeling chromatografie
> Technieken:
» Affiniteitschromatografie: scheiding obv reversibele interactie tussen doeleiwit en ligand
op matrix
» Ionchromatografie: scheiding obv interactie tussen geladen eiwit en tegengesteld
geladen matrix
» Gelfiltratie: scheiding obv verschil in vorm en grootte
» Hydrofobic interaction: scheiding obv interactie tussen eiwit en hydrofobe oppervlak in
medium
» Reverse fase: scheiding obv hydrofobiciteit
> Elke stap moet op 4 punten geoptimaliseerd worden: resolutie, opbrengst, snelheid en capaciteit
1.5 Apparatuur
1.5.1 Basisopstelling LPC
> Peristaltische pomp
> Kolom
> Adaptors
> Detector
> Fractiecollector
> Recorder
1.6 Matrixmateriaal
> Goede elutie-eigenschappen: grootte en porositeit zijn bepalend
> Hydrofiele karakter: gelkorrels eerst zwellen
> Chemische resistentie: tegen wisselende omstandigheden
> Biologisch resistent
> (mesh-waarde = distributie van de korrelgrootte)
6
Biochemische technieken
Deel 3: Chromatografie
Inhoudsopgave
1 Chromatografie ......................................................................................................................... 3
1.1 Inleiding ..................................................................................................................................... 3
1.2 Begrippen en formules ................................................................................................................ 3
1.2.1 Begrippen ............................................................................................................................. 3
1.2.2 Formules .............................................................................................................................. 3
1.3 Oplossend vermogen van een kolom ........................................................................................... 4
1.3.1 Invloed van kolom ................................................................................................................. 4
1.3.2 Invloed van het fasensysteem ................................................................................................ 5
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’ ........................................................................................................ 5
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor a ........................................................................... 5
1.3.3 Invloed van k’, a en N op de resolutie R .................................................................................. 5
1.4 Indeling chromatografie .............................................................................................................. 6
1.5 Apparatuur ................................................................................................................................. 6
1.5.1 Basisopstelling LPC............................................................................................................... 6
1.6 Matrixmateriaal .......................................................................................................................... 6
2 Gelfiltratiechromatografie.......................................................................................................... 7
2.1 Principe ...................................................................................................................................... 7
2.2 Samenstelling van de gelkorrels .................................................................................................. 7
2.3 Zwellen van de gelkorrels ............................................................................................................ 7
2.4 Verwijderen van lucht .................................................................................................................. 7
2.5 Kwantitatieve benadering ............................................................................................................ 8
2.5.1 Samenstelling van het kolomvolume ...................................................................................... 8
2.5.2 Elutievolume ......................................................................................................................... 8
2.6 Fractioneringsbereik ................................................................................................................... 8
2.7 Oplossend vermogen .................................................................................................................. 9
2.7.1 Poriënvolume ........................................................................................................................ 9
2.7.2 Korreldiameter ...................................................................................................................... 9
2.7.3 Bepaling van elutievolume ..................................................................................................... 9
2.8 Toepassingen ............................................................................................................................. 9
2.8.1 Scheiding van groepen moleculen .......................................................................................... 9
2.8.2 Fractionering....................................................................................................................... 10
1
,3 Ionenchromatografie ................................................................................................................ 10
3.1 Inleiding ................................................................................................................................... 10
3.2 Elektrostatische aantrekking ..................................................................................................... 10
3.3 Ionenuitwisseling ...................................................................................................................... 11
3.3.1 Associatieconstante KA,B ...................................................................................................... 11
3.3.2 Selectiviteitsconstante ........................................................................................................ 11
3.4 Ionenuitwisselaars .................................................................................................................... 11
3.4.1 De matrix ............................................................................................................................ 11
3.4.2 Soorten ionogene groepen ................................................................................................... 11
3.4.2.1 Kationenuitwisselaar .................................................................................................... 11
3.4.2.2 Anionenuitwisselaar ..................................................................................................... 12
3.4.2.3 Complexvormende ionenuitwisselaars .......................................................................... 12
3.4.3 Spacer arms ....................................................................................................................... 12
3.4.4 Capaciteit ........................................................................................................................... 13
3.4.5 Toepassingen van eenvoudige ionenuitwisseling .................................................................. 13
3.5 Ionenchromatografie ................................................................................................................ 13
3.5.1 Ionenchromatografie van kleine ionen .................................................................................. 13
3.5.2 Ionenchromatografie van grote ionen ................................................................................... 13
3.5.3 Praktische uitvoering van ionenchromatografie .................................................................... 14
3.5.3.1 Keuze van ionenuitwisselaar ......................................................................................... 14
3.5.3.2 Elutie............................................................................................................................ 15
4 Affiniteitschromatografie .......................................................................................................... 16
4.1 Principe .................................................................................................................................... 16
4.2 Matrix ....................................................................................................................................... 16
4.2.1 Eisen .................................................................................................................................. 16
4.2.2 Soorten gels ........................................................................................................................ 17
4.2.2.1 Geactiveerde gels: ........................................................................................................ 17
4.2.2.2 Ready-to-use gels ......................................................................................................... 17
4.3 Elutie........................................................................................................................................ 18
5 Hydrofobe interactiechromatografie (HIC) ................................................................................. 18
5.1 Principe .................................................................................................................................... 18
5.2 Uitvoering ................................................................................................................................. 18
2
,1 Chromatografie
1.1 Inleiding
> Standaard vloeistofchromatografie = LPC
» Gewerkt met grote korrels, grote kolommen en lage druk (peristatisch pompje)
» Voordeel: voor preparatieve bereidingen + grote monsters
» Nadeel: tijdrovend en beperkte resolutie
» Biomoleculen om te scheiden (EW of NZ)
> Fast performance liquid chromatografie = FPLC
1.2 Begrippen en formules
1.2.1 Begrippen
Begrip Definitie
Retentietijd tR Tijd tussen opbrengen van staal en piekmaximum
Tijd die solvent nodig heeft om door kolom te
Dode tijd to
migreren
Tijd tussen verschijnen van piekmaximum en de
Netto retentietijd t’R
solventpiek
HETP Hoogte equivalent met theoretische plaat
Verwijderen van product van kolom door
Elutie
oplossing in eluens
Eluaat Eluens dat uit kolom komt
Solventreeks gerangschik volgens stijgende
Elutrope reeks
eluerende kracht
Flow rate Snelheid waarmee mobiele fase door kolom gaat
Sedimentatie Gesuspendeerde deeltjes die uitzakken
Reversed phase Stationaire fase lagere polariteit dan mobiele fase
Resolutiefactor R Maat voor de scheidingscapaciteit van de kolom
Verhouding van concentraties in de stationaire en
Verdelingscoëfficiënt K
mobiele fase
Verhouding van hoeveelheden in stationaire en
Capaciteitsfactor k’
mobiele fase
Permeabiliteit Kp Invloed van de pakking op de lineaire snelheid
1.2.2 Formules
> Schotelgetal: bepaalt efficiëntie van kolom en slaat op 1 component
$, $,
N = 16.[ )
] 2 = 5,55 [ )'/! ] 2
. . )
HETP = / = '0 [ $% ] 2
!∗($ ! %!&$ ! %') R = 1: W1+W2 = 2*(tR1-tR2)
> Resolutie = R = )'*)! R < 1: overlap tussen pieken
R > 1: goede scheiding
> Lineaire snelheid
.
𝜇 = $1 23454462478 931:3;4;$ 7; 13<7464 =>?4
𝜈= $3$>64 23454462478 931:3;4;$
𝜈 = $%
. = fractie in mobiele fase * µ
3
, @?
> Verdelingscoëffciënt K = @1
@?∗A? A?
> Capaciteitsfactor k’ k’ = =K*
@1∗A1 A1
> Retentiefactor Rf B $D
Rf = =
C $%
$ ! %!
> Relatieve retentie = selectiviteitsfactor (bepaalt efficiëntie van fasensysteem) 𝛼 = $ !%'
>
> Pieksymmetrie T = < (met a > b )
!∗#∗$
> Permeabiliteit Kp = 1atm = 760mmHg = 1013 mbar = 101,3 kPa = 14,7 psi
%
1.3 Oplossend vermogen van een kolom
> Bepaald door efficiëntie van kolom en fasensysteem
> Goed resultaat: a en N zijn groot
1.3.1 Invloed van kolom
> Van Deemtervergelijking:
!
H = A + + C*µ
"
Onvolledige
Eddy diffusie Longitudale
evenwichtsinstelling
diffusie
H = HETP
@E
H = A + B’ * T + µ = lineaire elutiesnelheid
F
T = temperatuur
> Te lage snelheid: te veel diffusie
> Te hoge snelheid: onvoldoende uitwisseling tussen de 2 delen
4
,Eddy-diffusie
> A = 2*l*dP
> (l = stapelingsfactor en dP = diameter korrels)
> Als korrels verschillend zijn van grootte en 2 dezelfde moleculen gaan door kolom
> Gelijke moleculen volgen niet allemaal zelfde weg à krijgen verschillende snelheid (oranje en
roze lijnen)
> Verschillende verblijftijd in kolom geeft bredere of smallere pieken
> Diameter van korrels geeft verschillende vormen
> Goede kolom heeft beads met gelijke grootte en ook kleine beads
Longitudinale diffusie
> B = 2*Q*Dm (niet bolvormige deeltjes)
G.F G.F
> Met D = =
= 0∗I∗J∗% (bolvormige deeltjes)
> Draagt ook bij tot de zoneverbreding
> Hoe minder lang component in mobiele fase, hoe minder verbreding
Evenwichtsinstelling
GE 8= " GE 8:"
> C = C’S * ('*G !)" + Cm’[ '*GE ] 2 * K1
K?
> Weerstand tegen stofoverdracht
> Te grote elutiesnelheid geeft onvolledige evenwichtsinstelling en dus piekverbreding (willen C zo
laag mogelijk)
1.3.2 Invloed van het fasensysteem
1.3.2.1 Capaciteitsfactor k’
> Maat voor de vertraging van een component door de stationaire fase @?∗A? A?
k’ = @1∗A1 = K * A1
> Kenmerken:
» Afhankelijk van temperatuur
.(G ! *')
» Onafhankelijk van kolomlengte en elutiesnelheid tR = C
» Afhankelijk van contactoppervlak met stationaire
» Afhankelijk van polariteit van mobiele fase
» Beïnvloedt de retentietijd
» Ideale waarden liggen tussen 1 en 5
» Hoe groter k’ hoe groter de scheidingstijd en omgekeerd
1.3.2.2 Relatieve retentie of scheidingsfactor a
> Maat voor de selectiviteit van fasensysteem
$ ! %! GE!
𝛼= 𝛼 = GE'
$ ! %'
1.3.3 Invloed van k’, a en N op de resolutie R
> Bij R = 1,0 overlappen pieken elkaar voor 2%, componenten zijn 98% gescheiden
> Bij R = 1,5 is de overlapping maar 0,3%, de componenten zijn 99,7% gescheiden
5
, > Bij R = 0,5 is de scheiding nog zeer onvolledig
> Indien R < 1 dan kan men de resolutie verhogen door een van de 3 factoren te verhogen
> Invloed schotelgetal: smalle of brede pieken
> Invloed capaciteitsfactor: maat voor vertraging van de stationaire fase
> Invloed relatieve retentie: afstand tussen pieken
> Invloed op resolutie: als we N met factor 4 verhogen, zal resolutie verhogen met
factor 2
a -1 k' 1 L
R= . ' 2 .
a k2 + 1 4 H
> Invloed op retentietijd: als resolutie x2 verhoogd zal retentietijd x4 verhogen (bij
behoud vd elutiesnelheid)
1.4 Indeling chromatografie
> Technieken:
» Affiniteitschromatografie: scheiding obv reversibele interactie tussen doeleiwit en ligand
op matrix
» Ionchromatografie: scheiding obv interactie tussen geladen eiwit en tegengesteld
geladen matrix
» Gelfiltratie: scheiding obv verschil in vorm en grootte
» Hydrofobic interaction: scheiding obv interactie tussen eiwit en hydrofobe oppervlak in
medium
» Reverse fase: scheiding obv hydrofobiciteit
> Elke stap moet op 4 punten geoptimaliseerd worden: resolutie, opbrengst, snelheid en capaciteit
1.5 Apparatuur
1.5.1 Basisopstelling LPC
> Peristaltische pomp
> Kolom
> Adaptors
> Detector
> Fractiecollector
> Recorder
1.6 Matrixmateriaal
> Goede elutie-eigenschappen: grootte en porositeit zijn bepalend
> Hydrofiele karakter: gelkorrels eerst zwellen
> Chemische resistentie: tegen wisselende omstandigheden
> Biologisch resistent
> (mesh-waarde = distributie van de korrelgrootte)
6
