Samenvatting farmaceutische biotechnologie : biotechnologische productiemethoden

DEEL 1 : BIOTECHNOLOGISCHE PRODUCTIEMETHODEN
1. Biotechnologisch gebruik van genetisch ongewijzigde micro-organismen
Productie van biomassa door micro-organismen = FERMENTATIE

Kweek in een reactietank (fermentor) :
 Micro-org. er in met minimaal voedingsmilieu/groeimedium
- C-bron (bv glucose) → ATP
- N-bron (bv ammonium) → aminozuren aanmaken
- Zouten en sportenelementen → belang bij optimale groei
 Deze fermentoren zijn kleiner voor research maar kunnen tot duizenden liters zijn in de
industrie

Fermentatie processen
 Batch proces (meest eenvoudige)
- Fermentor + groeimed. + micro-org. → fermentatie tot een gewenst punt
bereikt is (bv celdensiteit, concentratie,…)
- Inhoud van tank verwijderd en eindproduct geïsoleerd
 Continue proces
- Na toevoegen micro-org. continue vers medium/nutriënten toevoegen &
reactiemengsel (micro-org. en product) wordt afgetapt
- Handig voor bv micro-org. die moeilijk groeien
 Continue proces met celrecylcering
- Reactiemengsel ook afvoeren maar de cellen/micro-org. afscheiden en
recycleren
- Langere fermentatie (dagen)

Gebruikte micro-organismen
Doorgaans GRAS (generally recognized as safe-) organismen
 Bacteriën : bv Bacillus, Streptomyces
 Schimmels : bv Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus
 Gisten : bv Saccharomyces cerevisiae

GRAS-organismen zijn :
 Niet pathogeen
 Niet toxisch
 Produceren meestal geen antibiotica
➔ Veilige productie van het gewenste eindproduct

Eindproducten
Enzymen, eenvoudige organische chemicaliën, geur-en smaakstoffen, polysachariden,
antibiotica, aminozuren enz.

,2. Recombinant DNA technologie
2.1 Inleiding
Structuur DNA en RNA
→ zie ppt (pagina 9-12)

mRNA synthese
Transcriptie = omzetting van DNA in boodschapper RNA (messenger RNA, mRNa)
 Zeer selectief : in zoogdiercellen wordt slechts 1% van het DNA omgezet in mRNA
 DNA afhankelijk RNA POLYMERASE enzyme bindt op een promoter en synthetiseert een RNA
streng van 5’ naar 3’ richting tot aan een stopsignaal
 3 RNA polumerasen in eukaryoten
- RNA polymerase 1 : grote ribosomale RNAs
- RNA polymerase 2 : aanmaak mRNA
- RNA polymerase 3 : kleine stabiele RNAs waaronder tRNA

 mRNA’s worden gedurende de aanmaak gemodificeerd aan 5’ en 3’ einde om hun te
onderscheiden van de RNAs gemaakt door de andere polymerasen en zo aan te geven dat
deze omgezet moeten worden in proteïnen.
 het 5’ einde wordt ge-capped doortoevoeging van een gemethyleerd G nucleotide. Dit
gebeurt vrijwel onmiddellijk
 Dit is een 5’-5’ binding. Men gaat ervan uit dat een deel van de nodige enzymen gebonden zit
op het polymerase II.
 Deze 5’ cap zal een belangrijke rol spelen bij de eiwitsynthese (soort herkenning) en zou ook
het RNA beschermen tegen degradatie.




 Polyadenylatie van mRNA aan 3’ einde
- Herkenning van een polyadenylatiesignaal (AAUAAA) in het transcript door specifieke
RNA-bindende eiwitten
→ stopt transcriptie
→ klieving transcript door endonuclease
- Poly A polymerase voegt een staart van ~250 A’s toe aan het 3’ einde

,2.2 Isolaties
2.2.1 Isolatie genomisch DNA
DNA isolatie met behulp van commercieel verkrijgbare DNA isolatiekits
Werkwijze
 Isolatie cellen of weefsel
 Lyse van cellen in een lyse-oplossing
- Bacteriën
Cellen suspenderen in buffer met lysozyme (breekt
peptidoglycaanlaag en dus celwand af) , Triton X-100 (lost
membranen op) en RNase A (breekt RNA af) (37°C, 30min)

Buffer met guanidine HCl (eiwitten denatureren) en proteinase K
(eiwitten afbreken) toevoegen (50°C , 30min)
- Gisten
Cellen suspenderen in buffer met lyticase (geen lysozyme want gwn
peptidoglycaan) , Triton X-100 en RNase A (30°C , 30min)

Buffer met guanidine HCl en proteinase K toevoegen (50°C , 30min)
- Dierlijke cellen (geen celwand)
Cellen suspenderen in buffer met Triton X-100 en RNase A (10 min
op ijs) ijs want bij openbreken cellen ku DNasen vrijkomen, we willen
dit remmen en DNA intact houden

Buffer met guanidine HCl en proteinase K toevoegen (50°C , 30min)
 Binding DNA op een matrix met positief geladen diethyl aminoethyl (DEAE)
groepen (DNA is negatief geladen)



 Was van DEAE-matrix met medium-zout concentraties (0,75-1M NaCl) (niet
gebonden materiaal wegspoelen)




 Elutie DNA van DEAE in hoog zout (>1,25M NaCl)
 Precipitatie DNA met isopropanol of ethanol (een alcohol-zout combinatie laat
DNA neerslaan, dan centrifugeren en oplossen in andere buffer bv water)

, DNA isolatie met behulp van silica membranen
Eigenschappen
 Silica (siliciumoxide) gebaseerd materiaal
 Selectieve adsorptie van DNA
Omgekeerde van daarnet  DNA binding onder hoge zoutconcentraties
 DNA elutie onder lage zoutconcentraties
 Geen organische of toxische reagentia
 Geen alcohol precipitatie
Binding DNA op silica
 In hoge zoutconcentraties
- Een chaotroop zout (bv guanidine HCl) zal de watermantel rond silica
verstoren
- Na+ ionen vormen een zoutbrug tussen de negatief geladen silica en de
fosfaatgroepen op DNA
 In lage zoutconcentraties
- Rehydratatie van de silica matrix verbreekt de binding met DNA

2.2.2 RNA isolatie
Methode 1 : extractie met organische solventen
 Zure fenol/chloroform/isoamylalcohol (pH<6 anders DNA ook in waterige fase)
toevoegen aan cellysaat
 Emulsie maken door vortexen
 Centrifugeer tot 3 fasen
 Neem waterige fase en precipiteer RNA met isopropanol




Methode 2 : solid-phase extractie met silica
 Isolatie cellen of weefsel
 Lyse van cellen in een lyse-oplossing (met guanidine thiocyanaat) → krachtige
RNase remmer dus inactiveert
 Binding RNA op silica matrix
 Wassen gebonden RNA
 Elutie RNA van silica
 Vaak voegt men DNasen toe zodat DNA niet gaat binden

Knelpunt bij RNA isolaties : snelle afbraak van RNA door stabiele RNases