Experimentele Cellulaire en Moleculaire Biologie II
Hoofdstuk 1 - Genomics, transcriptomics en proteomics
Genoom = alle DNA in een organisme, inclusief genen -> ligt ook vast
-> Genen bevatten informatie voor aanmaken van alle eiwitten, coderende sequenties (de exonen)
Humane genoomproject (HGP) => heeft nucleotidevolgorde van volledige menselijk DNA opgeleverd => ontdekking en
identificatie van vele nieuwe genen en single-nucleotide polymorfismes (SNPs) -> wanneer deze in de eiwitcoderende
sequenties van genen liggen, dragen zo bij tot het ontstaan van ziektes door veranderingen in aminozuursequentie
Om de rol van genen in normale celfuncties te bestuderen, is het belangrijk de specifieke expressie van genen in
verschillende celtypes en in verloop van tijd te kennen -> afwijkingen hierop spelen een rol in het ontstaan van ziektes
Genexpressie kan bepaald worden door te kijken naar de aanwezigheid van: (= mRNA en protein profiling resp.)
- mRNA
Nadeel: niet alle mRNAs in elke cel worden vertaald in eiwitten + translatiesnelheid tussen mRNAs verschilt
- Eiwit in de cel -> belangrijk aangezien er veel meer eiwitten bestaan dan genen (door alternatieve splicing van
pre-mRNAs in de kern of door proteolyse van eiwitten)
=> Concentraties aan mRNA en eiwit van een groot aantal genen te gelijk te bepalen
-> Concentratie aan eiwitten/mRNA in de cel wordt strikt gereguleerd via een aantal processen: [eiwit]/[mRNA] in cel
afhankelijk van aanmaaksnelheid en afbraaksnelheid -> stijging van [eiwit]/[mRNA] kan bereikt worden door stimulatie
van synthese of remming van afbraak => regulatie op 4 niveaus:
- Transcriptie (mRNA synthese) -> meest gangbare manier om eiwitniveaus in de cel te moduleren
post- - mRNA afbraak
transcriptionele - Translatie (eiwit synthese)
regulatie
- Eiwit afbraak
Genomics = studie van geheel genoom van organisme; onderzoek naar genen en hun functie (DNA sequencering)
=> achterhalen of bepaalde aandoening gerelateerd is aan bepaalde mutatie in eiwit
Transcriptoom = complete set van alle RNAs en hun concentraties in een cel of celpopulatie
Transcriptomics = studie van genexpressie patronen op mRNA niveau op grote schaal -> varieert per celtype en tijdstip
=> Nagaan of bepaalde afwijkingen in de normale genexpressie patronen gepaard gaan met ziektes
Proteoom = verzameling van alle eiwitten van een organisme (alle proteinen die worden gecodeerd door het genoom)
Proteomics = studie van genexpressie patronen op eiwit niveau op grote schaal -> varieert per celtype en tijdstip
=> Nagaan of bepaalde afwijkingen in de normale genexpressie patronen gepaard gaan met ziektes
Next Generation Sequencing (NGS) = high-throughput sequencing -> verzamelnaam van aantal moderne sequenering
technologieën -> laat toe om DNA en RNA zeer efficiënt en op relatief korte tijd te sequeneren
VB.: Whole Genome Sequencing (WGS), Whole Exome Sequnecing (WES, Exome-Seq), Methylation sequencing (Methyl-
Seq), RNA sequencing (RNA-Seq)
1 gen = 1 eiwit hypothese => onjuist -> 1 gen kan via alternatieve splicing coderen voor meerdere mRNAs => meerdere
eiwitten -> ongeveer ¼ van de genen worden veronderstelt gemiddeld 3 eiwitten te produceren via alternatieve splicing
-> Proteolyse: genen gaan aanleiding geven tot 1 eiwit precursor door het splitsen van eiwitten door proteasen =>
coderen dan voor meerdere eiwitten
1
,Hoofdstuk 2 - mRNA synhtese en afbraak
Kijken naar concentratie mRNA in een cel aanwezig om twee condities met elkaar te gaan vergelijken?
VB.: controleconditie en conditie gestimuleerd met hormoon/groeifactor -> naast stimulatie van cellen, is er ongeveer. 3
keer meer mRNA van gen A ten opzichte van de controle -> we weten op dit moment nog niet of dat die stijging in
concentratie het gevolg is het gevolg is van verhoging in synthese of het gevolg van een vermindering van afbraak
-> Als we synthese gaan verhogen => meer en meer mRNA, maar kan ook zijn dat afbraak wordt gestopt door stimulatie
met bijvoorbeeld groeifactor/hormoon
=> Nuclear run on assay
Techniek om mRNA synthese snelheid te bepalen = hoeveel mRNA wordt er per tijdseenheid gesynthetiseerd ->
In kern: mRNA synthese: kernen van cellen isoleren -> detergens -> maakt alle lipiden en membranen kapot ->
centrifugeren: twee fracties – pellet met kernen // – supernatant met cytosol en andere cel => geïsoleerde kennen
incuberen met gelabeld en NTPs, waarvan er ééntje gelabeld is -> gedurende een bepaalde tijdsperiode incuberen ->
mRNA transcriptie -> mRNA extraheren uit de kernen (ook het nieuw aangemaakte) -> op nylon filter aanbrengen met
cDNA probes gericht tegen onze genen van interesse -> ongebonden materiaal wegwassen -> hoeveelheid radioactiviteit
of recensie aan filter gebonden meten
-> Huishoudgenen worden constant aan een eenduidig tempo aangemaakt => constante aanvoer van nieuw mRNA om
nieuwe eiwitten te maken => synthese snelheid niet afhankelijk zijn van onze stimulus
Actinomycine D
Techniek om mRNA afbraaksnelheid te bepalen = tijdskinetiek met/zonder afwezigheid van actinomycine
D (transcriptieremmer van schimmels) -> intercaleert in DNA => kan niet ontbonden worden => polymerase
kan niet binden => synthese geblokkeerd => mRNA concentratie daalt door verhoogde afbraak
-> Maar wordt ook bepaald door de translatiesnelheid => moet gelijk blijven
Wanneer DEX aanwezig is, is er een steilere/snellere daling => DEX bevordert de afbraak
Hoe reguleert de cel mRNA afbraak?
mRNA wordt afgebroken door 5’/3’ exonucleases -> cel heeft mechanismen om zich tegen de afbraak te beschermen:
- Compartimentalisatie: mRNA in kern / exonucleases in lysosomen
- Aanbrengen 5’ cap: op het moment dat mRNA wordt aangemaakt, nadat transcriptie gestart is, gaat er een 5’
cap (= 7-methyl-guanosine) worden aangebouwd => 5’ exonucleases herkennen het niet + 5’-5’-trifosfaat
verbinding zorgt ervoor dat het niet gekliefd kan worden door 5’ exonucleases
- Polyadenylering van 3’-einde: wanneer polyadenylatie signaal zichtbaar/aanwezig is (AT/AU-rijke regio) =>
toevoegen van Poly A staart
- Poly A binding protein: mRNA wordt opgevouwd in typische 3D structuur met 5’ cap en 3’-einde naast elkaar
=> niet meer toegankelijk voor exonucleases
Hoe mRNA afbraak stimuleren?
Deadenylases met de-capping enzymen => beide kanten zijn weer vrij voor exonucleases => afbraak mRNA
Endonuclease afhankelijk mRNA afbraak: proces voor alfa-globine, transferrine receptor, IGF-II => endonucleases
knippen middenin het mRNA => hebben daar een clievage site -> geflankeert door eiwit-bindende site => zo lang dat het
eiwit hierop bindt is het mRNA beschermt => onder bepaald omstandigheden (signaaltransductie, fosforylatie), komt het
eiwit los => endonucleases kunnen hier nu wel in knippen => kanten zijn vrij => exonuclease nemen werk over
Regulatoire regio’s (= cis-acting elements) in mRNA die degradatie reguleren:
- Sequenties in 3’-UTR: AU-Rich Elements (ARE) in 3’-UTR // histon mRNA stem-loop determinants (histonen
hebben geen poly A staarten)
- Sequenties in 5’-UTR: Jnk-Responsive Elements (JRE) van IL2
- Sequenties in Open Reading Frames (ORFs): beta-tubuline
=> Groot aantal bindingseiwitten gekend die kunnen binden op deze regio's -> afhankelijk van eiwit tot eiwit, kunnen die
(de)stabiliserend werken => afhankelijk van stimulus die de cel gaat krijgen, welk eiwit dat (niet) zal binden
VB.: Iron-response elements (IRES) die voorkomen in mRNA coderen voor transferrine receptor -> bepaalt ijzer-opname in
cel => hoeveelheid ijzer in cel aanwezig is, moet heel sterk controleert worden -> te veel ijzer = oxidatieve stress => cel
dood: bindingseiwitten geïnactiveerd => binden niet meer => snelle afbraak van mRNA // te weinig ijzer = bindings-
protein voor iron response elements bindt => beschermt tegen polyadenylatie gemedieerde afbraak => geen translatie
Histonen hebben geen poly A staarten -> zorgen voor opbouwen van chromatine en compact maken van DNA
-> Op het moment dat de celcyclus doorlopen wordt en vooral wanneer dat de S fase plaatsvindt (synthese fase -
replicatie van DNA), moeten er heel veel histonen aangemaakt worden
2
,-> Nadat de S fase doorlopen is, gaat dat terug moeten rusten -> mogelijk doordat er in de 3’ UTR een geconserveerde
stemloop zit => kan gebonden worden door opnieuw een binding en andere factoren -> zolang dat binding protein
aanwezig is, zal het het mRNA stabiliseren + translatie bevorderen
Sequenties in coderende regio’s kunnen ook zorgen voor regulatie van mRNA
VB.: beta-tubuline transcript waarbij de eerste 4 AZ van het eiwit zelf binden aan de coderende regio => mRNA
gedestabiliseerd -> directe negatieve feedback, waarbij geldt dat als er al eiwit aanwezig is er geen nieuwe nodig is
Verstoring van de regulatie van mRNA afbraak kan leiden tot bepaalde ziektebeelden
VB.: Alzheimer kan veroorzaakt worden door een mutatie in IRE en IREBP => overmaat aan ijzer -> stapelt op in cellen =>
oxidatieve stress -> samen met inflammatie zorgt het voor neurodegeneratie => symptomen van Alzheimer
VB.: Auto-immuunziekten bij verstoring van mRNA afbraak -> 3’ UTR van IFN-gamma en IL-6 waarin SNPs aanwezig zijn
die zorgen voor een hogere stabiliteit => hogere expressie van IFN-gamma en IL-6 => stekere IMR => autoimmuniteit
=> Regulatie van mRNA afbraak is een manier voor de cel om heel snel, op een veranderende omgeving te reageren
(synthese van mRNA en het effect daarvan kan soms veel langer gaan duren)
Wat is het belang van RNA regulatie of de mRNA translatie te laten doorgaan?
Voor de regulatie van mRNA translatie is het van belang te onthouden dat de mRNA/eiwit ratio verschilt per gen en
dat sommige mRNA in bepaalde celtypes niet, nauwelijks of heel snel vertaald worden
VB.: TNF-alfa in monocyten en macrofagen -> mRNA niet altijd vertaald => monocyten en macrofagen moeten snel
kunnen reageren -> mRNA van TNF-alfa altijd aanwezig in cel -> gestockeerd en overgeschreven na activatie
Hoe mRNA translatie stimuleren?
- Gebruik van sequenties in 5’ UTR
VB.: IREs van ferritine mRNA -> wanneer deze worden gebonden door IREBP zal het ribosoom niet kunnen binden aan de
start-codon => geen translatie -> gereguleerd door hoeveelheid ijzer in cel:
-> Veel ijzer => IREBP inactief => IRE bindt niet => translatie niet geblokkeerd en ferritine aangemaakt -> nodig omdat
ferritine vrij ijzer zal binden en zo het vrij ijzer in de cel verlagen
-> Weinig ijzer => de IREP actief => IREs binden in 5’ UTR => ribosoom kan niet binden => translatie geblokkeerd => geen
ferritine aangemaakt omdat er ook geen vrij Fe in de cel is om mee te complexeren
- Via poly-A staart - stabiliteit en translatie van mRNA verhoogt
-> Regio’s in 5’-UTR reguleren translatie van bindingseiwitten
VB.: in oocyten van kikkers: in immature oocyten zijn er transcripten met korte poly A staarten -> translationeel dormant
=> mRNA in gestockeerd, maar worden niet overgeschreven => gevolg van maskine: vormt brug tussen initiatiecomplex
en cytoplasmic polyadenylation element (= U-rijke regio gelegen voor poly A signaal):
-> Brug aanwezig is: factoren nodig om poly A staart te maken binden niet
-> Brug verbroken door stimulus van hormonen -> fosforyleert cytoplasmic polyadenylation element => binding met
maskine verbroken => polyadenlyatie kan wel plaatsvinden => poly A staart aangemaakt
=> Poly-A staart van belang voor 3D-structuur, bescherming tegen exonucleasen en interactie met translatie complex =>
reguleert de mRNA stabiliteit en translatie via bindingseiwitten
- In 3’ UTR: door binding van miRNA’s -> 20-tal nucleotides -> binden heel specifieek aan 3’-UTR van mRNA =>
blokkeren translatie -> miRNA gevormd uit precursor miRNA door DICER-complex met ribonuclease II activiteit
die de stem-loop van de precursor afknipt => miRNA wordt dubbelstrengig -> kan niet aan mRNA binden ->
hiervoor moet het eerst door RISC (RNA-induced silencing complex) ontvouwen want deze zal de 5’-3’ guide
strand binden => 3’-5’ passenger strand gedegradeerd -> RISC-guide strand complex zal het 3’ UTR van het
mRNA binden => translatie voorkomen -> miRNA zullen in hun natuurlijk voorkomende vorm geen perfecte
match vormen met mRNA => blokkeert enkel translatie
VB.: ontdekkeing van miRNA: onderzoekers onderzochten het effect van mutaties en functie van lin14 en 28 genen op de
ontwikkeling van grondwormen => bij toeval op twee miRNAs gestoten: let-7 en 4 -> zijn gedeeltelijk complementair met
lin14 en 28: match maar niet 100% -> microRNAs worden niet vertaald
MicroRNAs ook gebruikt worden in labo om vertaling van eiwitten te blokkeren -> mRNA translatie voorkomen:
- miRNA precusor = niet 100% complementair; geen perfectematch met het mRNA -> remming/blokkering van de
translatie en trage mRNA afbraak
- Double stranded RNA = 100% complementair; perfect match met mRNA => snelle afbraak van mRNA
-> Bij single strand is de onderdrukking van de expressie van het eiwit veel minder efficiënt door dicer en RISC
complex (slecht opgeladen)
Eiwitsynthese en daaraan gekoppeld de snelheid in cel bepalen
Combinatie van verschillende technieken:
- Metabole labeling van eiwitten: eiwitten radioactief maken: intacte, levende cellen incuberen met radioactieve
AZ -> bij eiwitsynthese, worden deze ingebouwd in de eiwitten -> methionine en cysteïne met 35-S labelen
3
, - Immunoprecipitatie: alle eiwitten uit cel extraheren -> nieuw gesynthetiseerd eiwit van interesse opzuiveren
met immunoprecipitatie: inerte drager met antilichamen en beads (gebonden via eiwit A en G (sterk
immunoglobuline bindend => van zichzelf hoge affiniteit (vooral FC gedeelte) => Fab gedeelte van epitoop is nog
beschikbaar)) aan de eiwitten brengen => incuberen: bindingen => centrifugatie: pellet met beads en
antilichaam / supernatant met eiwitten
Belangrijk: we moeten antilichamen gebruiken de die het eiwit gaan herkennen in hun natuurlijke 3D conformatie = in
hun normale vorm waarin het in de cel voorkomt => bij western blot is het bijvoorbeeld anders aangezien daar de
antilichamen een primaire gedenatureerde structuur moeten herkennen
- PAGE uitvoeren met supernatant
- Autoradiografie: bandjes wijzen erop dat onze eiwit van interesse aanwezig is + dat gedurende de incubatie in
stap 1, ook actief in de cel werd vertaald
Controle: antilichamen gekoppeld aan beads op voorhand aan overmaat ongelabeld en dus niet radioactief eiwit
incuberen => alle bindingsplaatsen van het eiwit bezetten => dan deze gebruiken voor precipitatie => geen specifieke
binding kan plaats vinden => enkel als aspecifiek (banden die nu tevoorschijn komen ze aspecifiek)
=> Waarom zouden we deze techniek kunnen gaan gebruiken? Zien of het eiwit “molecule” X aanmaakt
VB.: stel dat we een immuunhistochemie kleuring doen van MM -> we zien dat er neerslag is door IL6 => we concluderen
dat IL-6 aanwezig is in MM, maar we weten nog niet of er synthese is => achterhalen door nuclear run on essay
Eiwitafbraak regulatie
Lysosomale afbraak:
- Na fagocytose (extracellulaire eiwitten)
- Na endocytose (extracellulaire eiwitten)
- Via autofagie (bij voedselgebrek):
o Micro- / macro-autofagie
o Chaperon gemedieerde autofagie = afbreken van eiwitten in cytosol -> bevat een KFERQ motief:
wanneer een cel beslist dat het eiwit afgebroken moet worden, gaat het motief naar het oppervlakte
door conformatieverandering => wordt zichtbaar -> chaperon complex Hsc70 kan er aan binden (komt
vooral voor bij voedselgebrek, celstress, ligand binding of eiwit-eiwit interactie, veroudering van
eiwitten, post-translationele modificaties: fosforylering)
-> Na chaperon binding: transport naar lysosoom -> complex bindt aan LAMP-2A receptor => eiwit
ontvouwt -> porie gevormd waarheen het eiwit wordt getransporteerd -> eiwit in lysosoom
-> Hsc70 = heat shock cognate = chaperon eiwit -> altijd aanwezig in de cel, expressie wordt verhoogd door
verhitting of stress -> herkent een KFERQ motief in eiwitten (KFERQ = consensus sequentie van 5 AZ, niet altijd 100%
identiek in elk eiwit) (Q = glumatine is altijd aanwezig -> rest is altijd met minstens één hydrofobe, basische en zure AZ)
Cytosolaire afbraak: via proteasoom -> wanneer ze gelabeld worden met ubiquitine (post-translationele modificatie)
Proteasoom = eiwitcomplex -> betrokken in regulatie van eiwitafbraak -> bestaat uit:
- Bovenste cap: zorgt voor eiwit-herkenning en ontvouwen tot primaire structuur door ATPasen
- Centrale holle cylinder: bevat ATP-afhankelijke proteasen: chymotrypsine-, caspase- of trypsine-like proteasen
(in de binnenste wand) => zorgen voor de afbraak van eiwitten
- Onderste cap
-> Eiwitten die moeten afgebroken worden zullen worden gelabeld met ubiquitine -> eiwit dat in alle eukaryote cellen
aanwezig is -> ubiquitinering van eiwitten wordt uitgevoerd door 3 enzymen:
- E1 – ubiquitine activating enzym: zorgt voor activatie van ubiquitine -> bindt door AMP op de carboxylgroep van
eindstandig glycine, waarna het een thioesterbinding aangaat tussen cysteïne van E1 en gly van ubiquitine
- E2 – ubiquitine conjugating enzyme: neemt het geactiveerd ubiquitine van E1 over en plaatst het op het
substraat => isopeptide binding gevormd tussen epsilon-aminogroep van lys op substraat en carboxylgroep van
gly ubiquitine -> geholpen door E3
- E3 – ubiquitine ligase: bepaald specificiteit van substraat: kiest welk eiwit er wel/niet wordt geubiquitineerd ->
E3 zal een complex (brug) vormen met E2 en het af te breken eiwitten => beide dicht bij elkaar => isopeptide
binding kan gaan plaatsvinden
-> Er bestaan verschillende soorten E3 ligasen:
- RING (really interesting new gene) finger domain E3 ligase: werkt als scaffold eiwit om ubiquitine en het
substraat dichter bij elkaar te brengen -> enzym zelf heeft geen katalytische activiteit maar zal door allosterische
binding op E2 dit enzym activeren => substraat geubiquineerd
- HECT (homologous to E6/AP C-terminus) domain E3 ligase: wordt zelf geubiquineerd -> bevat 2 domeinen: N-
en C-end lob -> substraat en E2 hebben bindingsplaatsen op N-end lob en zullen hier binden -> C-end lob hangt
vast aan hinge loop => zeer flexibel kan bewegen => ubiquitine van E2 overnemen en op substraat plaatst
- N-end rule ubiquitin E3 ligasen herkent de primaire structuur (N-terminus van glu of asp met aan het einde arg)
-> regulatie van afbraak door het veranderen van N-terminus zodat deze sequenties pas wanneer het nodig zijn
4
Hoofdstuk 1 - Genomics, transcriptomics en proteomics
Genoom = alle DNA in een organisme, inclusief genen -> ligt ook vast
-> Genen bevatten informatie voor aanmaken van alle eiwitten, coderende sequenties (de exonen)
Humane genoomproject (HGP) => heeft nucleotidevolgorde van volledige menselijk DNA opgeleverd => ontdekking en
identificatie van vele nieuwe genen en single-nucleotide polymorfismes (SNPs) -> wanneer deze in de eiwitcoderende
sequenties van genen liggen, dragen zo bij tot het ontstaan van ziektes door veranderingen in aminozuursequentie
Om de rol van genen in normale celfuncties te bestuderen, is het belangrijk de specifieke expressie van genen in
verschillende celtypes en in verloop van tijd te kennen -> afwijkingen hierop spelen een rol in het ontstaan van ziektes
Genexpressie kan bepaald worden door te kijken naar de aanwezigheid van: (= mRNA en protein profiling resp.)
- mRNA
Nadeel: niet alle mRNAs in elke cel worden vertaald in eiwitten + translatiesnelheid tussen mRNAs verschilt
- Eiwit in de cel -> belangrijk aangezien er veel meer eiwitten bestaan dan genen (door alternatieve splicing van
pre-mRNAs in de kern of door proteolyse van eiwitten)
=> Concentraties aan mRNA en eiwit van een groot aantal genen te gelijk te bepalen
-> Concentratie aan eiwitten/mRNA in de cel wordt strikt gereguleerd via een aantal processen: [eiwit]/[mRNA] in cel
afhankelijk van aanmaaksnelheid en afbraaksnelheid -> stijging van [eiwit]/[mRNA] kan bereikt worden door stimulatie
van synthese of remming van afbraak => regulatie op 4 niveaus:
- Transcriptie (mRNA synthese) -> meest gangbare manier om eiwitniveaus in de cel te moduleren
post- - mRNA afbraak
transcriptionele - Translatie (eiwit synthese)
regulatie
- Eiwit afbraak
Genomics = studie van geheel genoom van organisme; onderzoek naar genen en hun functie (DNA sequencering)
=> achterhalen of bepaalde aandoening gerelateerd is aan bepaalde mutatie in eiwit
Transcriptoom = complete set van alle RNAs en hun concentraties in een cel of celpopulatie
Transcriptomics = studie van genexpressie patronen op mRNA niveau op grote schaal -> varieert per celtype en tijdstip
=> Nagaan of bepaalde afwijkingen in de normale genexpressie patronen gepaard gaan met ziektes
Proteoom = verzameling van alle eiwitten van een organisme (alle proteinen die worden gecodeerd door het genoom)
Proteomics = studie van genexpressie patronen op eiwit niveau op grote schaal -> varieert per celtype en tijdstip
=> Nagaan of bepaalde afwijkingen in de normale genexpressie patronen gepaard gaan met ziektes
Next Generation Sequencing (NGS) = high-throughput sequencing -> verzamelnaam van aantal moderne sequenering
technologieën -> laat toe om DNA en RNA zeer efficiënt en op relatief korte tijd te sequeneren
VB.: Whole Genome Sequencing (WGS), Whole Exome Sequnecing (WES, Exome-Seq), Methylation sequencing (Methyl-
Seq), RNA sequencing (RNA-Seq)
1 gen = 1 eiwit hypothese => onjuist -> 1 gen kan via alternatieve splicing coderen voor meerdere mRNAs => meerdere
eiwitten -> ongeveer ¼ van de genen worden veronderstelt gemiddeld 3 eiwitten te produceren via alternatieve splicing
-> Proteolyse: genen gaan aanleiding geven tot 1 eiwit precursor door het splitsen van eiwitten door proteasen =>
coderen dan voor meerdere eiwitten
1
,Hoofdstuk 2 - mRNA synhtese en afbraak
Kijken naar concentratie mRNA in een cel aanwezig om twee condities met elkaar te gaan vergelijken?
VB.: controleconditie en conditie gestimuleerd met hormoon/groeifactor -> naast stimulatie van cellen, is er ongeveer. 3
keer meer mRNA van gen A ten opzichte van de controle -> we weten op dit moment nog niet of dat die stijging in
concentratie het gevolg is het gevolg is van verhoging in synthese of het gevolg van een vermindering van afbraak
-> Als we synthese gaan verhogen => meer en meer mRNA, maar kan ook zijn dat afbraak wordt gestopt door stimulatie
met bijvoorbeeld groeifactor/hormoon
=> Nuclear run on assay
Techniek om mRNA synthese snelheid te bepalen = hoeveel mRNA wordt er per tijdseenheid gesynthetiseerd ->
In kern: mRNA synthese: kernen van cellen isoleren -> detergens -> maakt alle lipiden en membranen kapot ->
centrifugeren: twee fracties – pellet met kernen // – supernatant met cytosol en andere cel => geïsoleerde kennen
incuberen met gelabeld en NTPs, waarvan er ééntje gelabeld is -> gedurende een bepaalde tijdsperiode incuberen ->
mRNA transcriptie -> mRNA extraheren uit de kernen (ook het nieuw aangemaakte) -> op nylon filter aanbrengen met
cDNA probes gericht tegen onze genen van interesse -> ongebonden materiaal wegwassen -> hoeveelheid radioactiviteit
of recensie aan filter gebonden meten
-> Huishoudgenen worden constant aan een eenduidig tempo aangemaakt => constante aanvoer van nieuw mRNA om
nieuwe eiwitten te maken => synthese snelheid niet afhankelijk zijn van onze stimulus
Actinomycine D
Techniek om mRNA afbraaksnelheid te bepalen = tijdskinetiek met/zonder afwezigheid van actinomycine
D (transcriptieremmer van schimmels) -> intercaleert in DNA => kan niet ontbonden worden => polymerase
kan niet binden => synthese geblokkeerd => mRNA concentratie daalt door verhoogde afbraak
-> Maar wordt ook bepaald door de translatiesnelheid => moet gelijk blijven
Wanneer DEX aanwezig is, is er een steilere/snellere daling => DEX bevordert de afbraak
Hoe reguleert de cel mRNA afbraak?
mRNA wordt afgebroken door 5’/3’ exonucleases -> cel heeft mechanismen om zich tegen de afbraak te beschermen:
- Compartimentalisatie: mRNA in kern / exonucleases in lysosomen
- Aanbrengen 5’ cap: op het moment dat mRNA wordt aangemaakt, nadat transcriptie gestart is, gaat er een 5’
cap (= 7-methyl-guanosine) worden aangebouwd => 5’ exonucleases herkennen het niet + 5’-5’-trifosfaat
verbinding zorgt ervoor dat het niet gekliefd kan worden door 5’ exonucleases
- Polyadenylering van 3’-einde: wanneer polyadenylatie signaal zichtbaar/aanwezig is (AT/AU-rijke regio) =>
toevoegen van Poly A staart
- Poly A binding protein: mRNA wordt opgevouwd in typische 3D structuur met 5’ cap en 3’-einde naast elkaar
=> niet meer toegankelijk voor exonucleases
Hoe mRNA afbraak stimuleren?
Deadenylases met de-capping enzymen => beide kanten zijn weer vrij voor exonucleases => afbraak mRNA
Endonuclease afhankelijk mRNA afbraak: proces voor alfa-globine, transferrine receptor, IGF-II => endonucleases
knippen middenin het mRNA => hebben daar een clievage site -> geflankeert door eiwit-bindende site => zo lang dat het
eiwit hierop bindt is het mRNA beschermt => onder bepaald omstandigheden (signaaltransductie, fosforylatie), komt het
eiwit los => endonucleases kunnen hier nu wel in knippen => kanten zijn vrij => exonuclease nemen werk over
Regulatoire regio’s (= cis-acting elements) in mRNA die degradatie reguleren:
- Sequenties in 3’-UTR: AU-Rich Elements (ARE) in 3’-UTR // histon mRNA stem-loop determinants (histonen
hebben geen poly A staarten)
- Sequenties in 5’-UTR: Jnk-Responsive Elements (JRE) van IL2
- Sequenties in Open Reading Frames (ORFs): beta-tubuline
=> Groot aantal bindingseiwitten gekend die kunnen binden op deze regio's -> afhankelijk van eiwit tot eiwit, kunnen die
(de)stabiliserend werken => afhankelijk van stimulus die de cel gaat krijgen, welk eiwit dat (niet) zal binden
VB.: Iron-response elements (IRES) die voorkomen in mRNA coderen voor transferrine receptor -> bepaalt ijzer-opname in
cel => hoeveelheid ijzer in cel aanwezig is, moet heel sterk controleert worden -> te veel ijzer = oxidatieve stress => cel
dood: bindingseiwitten geïnactiveerd => binden niet meer => snelle afbraak van mRNA // te weinig ijzer = bindings-
protein voor iron response elements bindt => beschermt tegen polyadenylatie gemedieerde afbraak => geen translatie
Histonen hebben geen poly A staarten -> zorgen voor opbouwen van chromatine en compact maken van DNA
-> Op het moment dat de celcyclus doorlopen wordt en vooral wanneer dat de S fase plaatsvindt (synthese fase -
replicatie van DNA), moeten er heel veel histonen aangemaakt worden
2
,-> Nadat de S fase doorlopen is, gaat dat terug moeten rusten -> mogelijk doordat er in de 3’ UTR een geconserveerde
stemloop zit => kan gebonden worden door opnieuw een binding en andere factoren -> zolang dat binding protein
aanwezig is, zal het het mRNA stabiliseren + translatie bevorderen
Sequenties in coderende regio’s kunnen ook zorgen voor regulatie van mRNA
VB.: beta-tubuline transcript waarbij de eerste 4 AZ van het eiwit zelf binden aan de coderende regio => mRNA
gedestabiliseerd -> directe negatieve feedback, waarbij geldt dat als er al eiwit aanwezig is er geen nieuwe nodig is
Verstoring van de regulatie van mRNA afbraak kan leiden tot bepaalde ziektebeelden
VB.: Alzheimer kan veroorzaakt worden door een mutatie in IRE en IREBP => overmaat aan ijzer -> stapelt op in cellen =>
oxidatieve stress -> samen met inflammatie zorgt het voor neurodegeneratie => symptomen van Alzheimer
VB.: Auto-immuunziekten bij verstoring van mRNA afbraak -> 3’ UTR van IFN-gamma en IL-6 waarin SNPs aanwezig zijn
die zorgen voor een hogere stabiliteit => hogere expressie van IFN-gamma en IL-6 => stekere IMR => autoimmuniteit
=> Regulatie van mRNA afbraak is een manier voor de cel om heel snel, op een veranderende omgeving te reageren
(synthese van mRNA en het effect daarvan kan soms veel langer gaan duren)
Wat is het belang van RNA regulatie of de mRNA translatie te laten doorgaan?
Voor de regulatie van mRNA translatie is het van belang te onthouden dat de mRNA/eiwit ratio verschilt per gen en
dat sommige mRNA in bepaalde celtypes niet, nauwelijks of heel snel vertaald worden
VB.: TNF-alfa in monocyten en macrofagen -> mRNA niet altijd vertaald => monocyten en macrofagen moeten snel
kunnen reageren -> mRNA van TNF-alfa altijd aanwezig in cel -> gestockeerd en overgeschreven na activatie
Hoe mRNA translatie stimuleren?
- Gebruik van sequenties in 5’ UTR
VB.: IREs van ferritine mRNA -> wanneer deze worden gebonden door IREBP zal het ribosoom niet kunnen binden aan de
start-codon => geen translatie -> gereguleerd door hoeveelheid ijzer in cel:
-> Veel ijzer => IREBP inactief => IRE bindt niet => translatie niet geblokkeerd en ferritine aangemaakt -> nodig omdat
ferritine vrij ijzer zal binden en zo het vrij ijzer in de cel verlagen
-> Weinig ijzer => de IREP actief => IREs binden in 5’ UTR => ribosoom kan niet binden => translatie geblokkeerd => geen
ferritine aangemaakt omdat er ook geen vrij Fe in de cel is om mee te complexeren
- Via poly-A staart - stabiliteit en translatie van mRNA verhoogt
-> Regio’s in 5’-UTR reguleren translatie van bindingseiwitten
VB.: in oocyten van kikkers: in immature oocyten zijn er transcripten met korte poly A staarten -> translationeel dormant
=> mRNA in gestockeerd, maar worden niet overgeschreven => gevolg van maskine: vormt brug tussen initiatiecomplex
en cytoplasmic polyadenylation element (= U-rijke regio gelegen voor poly A signaal):
-> Brug aanwezig is: factoren nodig om poly A staart te maken binden niet
-> Brug verbroken door stimulus van hormonen -> fosforyleert cytoplasmic polyadenylation element => binding met
maskine verbroken => polyadenlyatie kan wel plaatsvinden => poly A staart aangemaakt
=> Poly-A staart van belang voor 3D-structuur, bescherming tegen exonucleasen en interactie met translatie complex =>
reguleert de mRNA stabiliteit en translatie via bindingseiwitten
- In 3’ UTR: door binding van miRNA’s -> 20-tal nucleotides -> binden heel specifieek aan 3’-UTR van mRNA =>
blokkeren translatie -> miRNA gevormd uit precursor miRNA door DICER-complex met ribonuclease II activiteit
die de stem-loop van de precursor afknipt => miRNA wordt dubbelstrengig -> kan niet aan mRNA binden ->
hiervoor moet het eerst door RISC (RNA-induced silencing complex) ontvouwen want deze zal de 5’-3’ guide
strand binden => 3’-5’ passenger strand gedegradeerd -> RISC-guide strand complex zal het 3’ UTR van het
mRNA binden => translatie voorkomen -> miRNA zullen in hun natuurlijk voorkomende vorm geen perfecte
match vormen met mRNA => blokkeert enkel translatie
VB.: ontdekkeing van miRNA: onderzoekers onderzochten het effect van mutaties en functie van lin14 en 28 genen op de
ontwikkeling van grondwormen => bij toeval op twee miRNAs gestoten: let-7 en 4 -> zijn gedeeltelijk complementair met
lin14 en 28: match maar niet 100% -> microRNAs worden niet vertaald
MicroRNAs ook gebruikt worden in labo om vertaling van eiwitten te blokkeren -> mRNA translatie voorkomen:
- miRNA precusor = niet 100% complementair; geen perfectematch met het mRNA -> remming/blokkering van de
translatie en trage mRNA afbraak
- Double stranded RNA = 100% complementair; perfect match met mRNA => snelle afbraak van mRNA
-> Bij single strand is de onderdrukking van de expressie van het eiwit veel minder efficiënt door dicer en RISC
complex (slecht opgeladen)
Eiwitsynthese en daaraan gekoppeld de snelheid in cel bepalen
Combinatie van verschillende technieken:
- Metabole labeling van eiwitten: eiwitten radioactief maken: intacte, levende cellen incuberen met radioactieve
AZ -> bij eiwitsynthese, worden deze ingebouwd in de eiwitten -> methionine en cysteïne met 35-S labelen
3
, - Immunoprecipitatie: alle eiwitten uit cel extraheren -> nieuw gesynthetiseerd eiwit van interesse opzuiveren
met immunoprecipitatie: inerte drager met antilichamen en beads (gebonden via eiwit A en G (sterk
immunoglobuline bindend => van zichzelf hoge affiniteit (vooral FC gedeelte) => Fab gedeelte van epitoop is nog
beschikbaar)) aan de eiwitten brengen => incuberen: bindingen => centrifugatie: pellet met beads en
antilichaam / supernatant met eiwitten
Belangrijk: we moeten antilichamen gebruiken de die het eiwit gaan herkennen in hun natuurlijke 3D conformatie = in
hun normale vorm waarin het in de cel voorkomt => bij western blot is het bijvoorbeeld anders aangezien daar de
antilichamen een primaire gedenatureerde structuur moeten herkennen
- PAGE uitvoeren met supernatant
- Autoradiografie: bandjes wijzen erop dat onze eiwit van interesse aanwezig is + dat gedurende de incubatie in
stap 1, ook actief in de cel werd vertaald
Controle: antilichamen gekoppeld aan beads op voorhand aan overmaat ongelabeld en dus niet radioactief eiwit
incuberen => alle bindingsplaatsen van het eiwit bezetten => dan deze gebruiken voor precipitatie => geen specifieke
binding kan plaats vinden => enkel als aspecifiek (banden die nu tevoorschijn komen ze aspecifiek)
=> Waarom zouden we deze techniek kunnen gaan gebruiken? Zien of het eiwit “molecule” X aanmaakt
VB.: stel dat we een immuunhistochemie kleuring doen van MM -> we zien dat er neerslag is door IL6 => we concluderen
dat IL-6 aanwezig is in MM, maar we weten nog niet of er synthese is => achterhalen door nuclear run on essay
Eiwitafbraak regulatie
Lysosomale afbraak:
- Na fagocytose (extracellulaire eiwitten)
- Na endocytose (extracellulaire eiwitten)
- Via autofagie (bij voedselgebrek):
o Micro- / macro-autofagie
o Chaperon gemedieerde autofagie = afbreken van eiwitten in cytosol -> bevat een KFERQ motief:
wanneer een cel beslist dat het eiwit afgebroken moet worden, gaat het motief naar het oppervlakte
door conformatieverandering => wordt zichtbaar -> chaperon complex Hsc70 kan er aan binden (komt
vooral voor bij voedselgebrek, celstress, ligand binding of eiwit-eiwit interactie, veroudering van
eiwitten, post-translationele modificaties: fosforylering)
-> Na chaperon binding: transport naar lysosoom -> complex bindt aan LAMP-2A receptor => eiwit
ontvouwt -> porie gevormd waarheen het eiwit wordt getransporteerd -> eiwit in lysosoom
-> Hsc70 = heat shock cognate = chaperon eiwit -> altijd aanwezig in de cel, expressie wordt verhoogd door
verhitting of stress -> herkent een KFERQ motief in eiwitten (KFERQ = consensus sequentie van 5 AZ, niet altijd 100%
identiek in elk eiwit) (Q = glumatine is altijd aanwezig -> rest is altijd met minstens één hydrofobe, basische en zure AZ)
Cytosolaire afbraak: via proteasoom -> wanneer ze gelabeld worden met ubiquitine (post-translationele modificatie)
Proteasoom = eiwitcomplex -> betrokken in regulatie van eiwitafbraak -> bestaat uit:
- Bovenste cap: zorgt voor eiwit-herkenning en ontvouwen tot primaire structuur door ATPasen
- Centrale holle cylinder: bevat ATP-afhankelijke proteasen: chymotrypsine-, caspase- of trypsine-like proteasen
(in de binnenste wand) => zorgen voor de afbraak van eiwitten
- Onderste cap
-> Eiwitten die moeten afgebroken worden zullen worden gelabeld met ubiquitine -> eiwit dat in alle eukaryote cellen
aanwezig is -> ubiquitinering van eiwitten wordt uitgevoerd door 3 enzymen:
- E1 – ubiquitine activating enzym: zorgt voor activatie van ubiquitine -> bindt door AMP op de carboxylgroep van
eindstandig glycine, waarna het een thioesterbinding aangaat tussen cysteïne van E1 en gly van ubiquitine
- E2 – ubiquitine conjugating enzyme: neemt het geactiveerd ubiquitine van E1 over en plaatst het op het
substraat => isopeptide binding gevormd tussen epsilon-aminogroep van lys op substraat en carboxylgroep van
gly ubiquitine -> geholpen door E3
- E3 – ubiquitine ligase: bepaald specificiteit van substraat: kiest welk eiwit er wel/niet wordt geubiquitineerd ->
E3 zal een complex (brug) vormen met E2 en het af te breken eiwitten => beide dicht bij elkaar => isopeptide
binding kan gaan plaatsvinden
-> Er bestaan verschillende soorten E3 ligasen:
- RING (really interesting new gene) finger domain E3 ligase: werkt als scaffold eiwit om ubiquitine en het
substraat dichter bij elkaar te brengen -> enzym zelf heeft geen katalytische activiteit maar zal door allosterische
binding op E2 dit enzym activeren => substraat geubiquineerd
- HECT (homologous to E6/AP C-terminus) domain E3 ligase: wordt zelf geubiquineerd -> bevat 2 domeinen: N-
en C-end lob -> substraat en E2 hebben bindingsplaatsen op N-end lob en zullen hier binden -> C-end lob hangt
vast aan hinge loop => zeer flexibel kan bewegen => ubiquitine van E2 overnemen en op substraat plaatst
- N-end rule ubiquitin E3 ligasen herkent de primaire structuur (N-terminus van glu of asp met aan het einde arg)
-> regulatie van afbraak door het veranderen van N-terminus zodat deze sequenties pas wanneer het nodig zijn
4
