Bio-informatica
Hoorcolleges
HOC 1 - Introductie tot NCBI/Ensembl
Databank = (electronisch) archief met informatie
NCBI = National Center for Biotechnology Information
ENCEMBL = Ensembl-genoomdatabaseproject = genoombrowsers met genetische en moleculaire informatie over het
menselijk genoom, alsook van andere diersoorten/modelorganismen
Accession number = toegangsnummer = uniek nummer toegekend aan een volledig document wanneer
een sequentie wordt gedeponeerd in een databank
Geninfo nummer = gen indentifier = worden toegekend door NCBI aan elke nieuwe sequentie die in de
ENTREZ database komt
Reference Sequence (RefSeq) = openbare databank -> bevat gestandaardiseerde, nauwkeurig geannoteerde referentie-
DNA-, RNA- en eiwitsequenties voor verschillende organismen
Locus = naam
Eiwit-databanken
→ SWISS-PROT(EUR): biedt annotaties op hoog niveau, inclusief beschrijvingen van de domeinen, functie; verbonden
met veel bronnen
→ TrEMBL (Vertaald EMBL; EUR): bevat vertalingen van alle coderende sequenties in EMBL
→ PIR (Protein Identification Resource; VS)
→ GENPEPT (VS): (VS) afgeleid van automatische GenBank vertalingen van coderende sequenties
→ Uniprot= Swiss-prot + TrEMBL
HOC 2 - NCBI advanced
OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) = uitgebreide, openbare database die informatie bevat over menselijke
genen en genetische aandoeningen -> richt zich op de relatie tussen genen en erfelijke ziektes en beschrijft de
genetische basis van verschillende aandoeningen, symptomen, overervingspatronen en soms behandelingsopties
OMIM entry statistics
- Asterisk (*): gen beschrijving met bekende sequentie
- Een nummer symbool (#): beschrijvende entry, meestal van een fenotype (geen unieke locus). De reden is
meestal gegeven
- Een plus teken (+): beschrijving van een gen met bekende sequentie en phenotype
- Een procent teken (%): beschrijving van een bevestigde medeliaanse erfelijkheid of phenotypische locus maar
waarvan het onderliggende moleculaire mechanisme niet bekend is
- Geen symbool: de mendeliaanse link is niet echt bewezen
- Table view: overzicht van allee bekende mutaties -> je kan via hier ook de klinische varianten vinden
PDB = Protein Data Bank
HOC 3 - Blast
BLAST = Basic Local Alignment Search Tool
-> Homologe regio’s tussen biologische AZ/NZ seq vinden, nucl/eiw sequenties vgl met seq uit de database en op basis
hiervan de statistische significantie berekenen
Wanneer heb ik een BLAST nodig?
- Als ik PCR primer wil vinden die specifiek zijn
- Identificatie van onbekend stuk nucleotide sequentie (blastn) in nucleinezuur databank
- Opzoek naar family member (blastp) -> aminozuursequentie zoeken in eiwit databank
- Opzoek naar hetzelfde eiwit in een andere soort (blastp) -> aminozuursequentie zoeken in eiwit databank
- Opzoek naar eiwitten met gelijkaardige domeinen (blastp) -> aminozuursequentie zoeken in eiwit databank
- Twee sequenties met elkaar vergelijken; mutaties (blastp/n)
Blastx -> vertaalde nucleinezuursequentie zoeken in eiwit databank
Tblastn -> aminozuursequentie zoeken in vertaalde nucleinezuursequentie databank
Tblastx -> vertaalde nucleinezuursequentie in vertaalde nucleinezuursequentie databank
→ Needleman en Wunsch: beschouwt gelijkenis over de volledige omvang van de sequenties
→ Smith – Waterman: richt zich op regio's van gelijkenis in delen van de sequences
1
,Welke blast: Zoek seq: Databank:
N: NZ seq NZen
P: AZ seq Eiwitten
X: Vertaalde NZ seq Eiwit
t-N: AZ seq Vertaalde NZ seq
t-X: Vertaalde NZ seq Vertaalde NZ seq
BLAST: filtering van regio’s met lage complexiteit
- Poly A staart
- Lange herhalingen van één NT of AZ
- Patroon van NT of AZ
- Coiled coil domeinen
- Zure AZ rijke gebieden
- Repetitief genomisch DNA
-> Worden uitgefilterd uit de zoeksequentie vooraleer een BLAST zoekopdracht wordt uitgevoerd
BLAST Statistics : cut-off value E (S ≥ x) = m*n*K*e- λ*x
- E = expect value = aantal keren dat een score gelijk/hoger dan x zal worden bereikt door toeval als we een
zoekopdracht uitvoeren met een gegeven query sequentie in een databank met totale lengte N
- m = sequentie lengte van de query
- n = totale lengte van de databank
- K and λ = parameters die afhankelijk zijn van « extreme value » distributie die ontstaat door met een gegeven
query sequentie te zoeken in een databank
- De « extreme value » distributie is uiteraard ook afhankelijk van de scoringsmatrix die men gebruikt heeft
Expected Value (E-waarde):
o Het aantal keren dat een score gelijk aan of hoger dan x zal worden bereikt door toeval als we een
zoekopdracht uitvoeren met een gegeven query sequentie in een databank met totale lengte N
-> Hoe kleiner, hoe beter
Max/totale score = berekende waarde a/d hand van gaps, deletie/inserties
Query coverage = percentage gelijk
HOC 4 - VNTI
Kloneren van genen -> mRNA uithalen -> cDNA integreren in plasmide -> veel kopies van gen
=> Functie achterhalen van een eiwit door overexpressie van eiwit in cellen / lokalisatie van eiwit in cel…
→ Reguleren van gen/eiwit
VNTI: sequenties beheren en analyseren + primers maken/beheren
-> Molecule viewer: toegang tot database (lijst meet genen), display set up, primer design
-> Local database
-> Sequence alignment tools
-> Primer
- Altijd 2 primers nodig en nooit op dezelfde strand
- Ongeveer de dezelfde annealing temperatuur
- Bepaald door lengte en GC content (tm = 4°C)
Blast2seq = alignX in VNTI
AllignX: Download 2 seq in NCBI => zet in database VNTI => open in VNTI met alignX => selecteer 2 seq in linker box =>
klik align sequences in bovenste kolom => bij een ruimte in rechterbox => kijken in seq waar er geen match is =>
screenshot
Voor distance tree in allignX: komt vanzelf bij meer dan 2 seq
Graphical display viewer: open 2 seq in VNTI => window => future map (linker box) => exonen => kijken welke bp
verschillen => dit exon is verschillend (bovenbalk drukken) => 2 seq op gelijke hoogte zetten => screenshot hele pagina!
Primers specifiek: highlight exon dat verschilt OF stukje dat niet gelijk is in AllignX => primerdisign (bovenbalk) => PCR
primers inside selection => ok => screenshot analyseventer (ook 3 boxen geven!) => weergeven in seq => voeg primer
toe aan oligolist (bovenbalk) => displaysetup (bovenbalk) => motief (add oligolist) => sequence setup (3) => ok =>
screenshot (highligt primers met stukje ertss + fwd op bovenstreng en rev onderstreng!) 100% is goed; 60% is niet
specifiek
2
,Alignment van 2 identieke sequenties, toch ontstaan 2 verschillende ketens
Of praktische vraag: 2 labo's, 1 gelijke DNA-sequentie, toch verschil AZ-sequentie vanaf AZ60. Hoe komt dit?
Dit komt door een frame shift: Bij dit type mutatie wordt het leesraam verschoven (er ontstaan hierdoor verschillende
codons). Het eiwit zal vanaf deze mutatie geheel veranderd zijn en evt geen functie meer kunnen vervullen. Dit kan
door een deletie/insertie
HOC 5
PCR: Polymerase Chain Reaction => meten van genexpressie
1. RNA-isolatie + Reverse Transcriptase-reactie: RNA geïsoleerd uit een monster -> RNA omgezet in
complementair DNA (cDNA) door reverse transcriptase-reactie -> cDNA is nodig als template voor PCR
2. PCR-amplificatie: gen-specifieke primers gebruiken om specifieke genen van interesse te amplificeren -> PCR-
machine (thermocycler) wordt gebruikt om cDNA te vermeerderen door cyclische temperatuurveranderingen
3. Agarosegel-electroforese: producten van PCR op agarosegel geplaatst om gescheiden te worden op basis van
grootte -> gel bevat kleurstof (ethidiumbromide) waarmee DNA-banden zichtbaar worden onder UV-licht
Kenmerken van deze methode:
- Niet arbeidsintensief, relatief eenvoudig
- Gel nodig voor visualisatie
- Kleine hoeveelheid RNA is nodig om cDNA te maken
- Semi-kwantitatief: resultaten geven schatting van genexpressieniveaus, maar zijn niet volledig kwantitatief
- Makkelijker om meerdere genen te testen
Kwantitatieve PCR (qPCR): PCR-machine detecteert amplificatie in real-time via fluorescentiesignaal => toename van
PCR-product tijdens elke cyclus worden gemeten => qPCR zeer nauwkeurigere en kwantitatievere data
Microarrays: krachtige techniek om expressieniveaus van duizenden genen tegelijkertijd te meten => grootschalige
genexpressiepatronen analyseren en vergelijken tussen verschillende celtypes of experimentele omstandigheden.
-> Microarrays = chips die duizenden DNA-probes bevatten die complementair zijn aan sequenties van genen die men
wil onderzoeken -> door gemerkt cDNA of RNA van monster op chip aan te brengen, kan men zien welke genen tot
expressie komen en in welke mate
1. RNA-extractie
2. Omzetting naar cDNA en labelen: RNA omgezet in complementair DNA (cDNA) via reverse transcriptase -> ook
gelabeld met fluorescerende/radioactieve markers zodat het gedetecteerd kan worden na hybridisatie
3. Hybridisatie op de microarray: gelabelde cDNA aangebracht op microarray-chip en hybridiseert met de DNA-
probes die aan de chip zijn gebonden
4. Wassen en detectie: chip gewassen om ongebonden of niet-specifiek gebonden cDNA te verwijderen -> chip
gescand met laser om fluorescerende signalen te detecteren en te meten.
5. Data-analyse: verkregen data geanalyseerd via bioinformatica-tools -> normalisatie van signalen en relatieve
vergelijking van expressie van verschillende genen op chip -> output is genexpressieprofiel dat laat zien welke
genen meer of minder tot expressie komen in het onderzochte monster
Kenmerken van genexpressieprofilering met microarrays:
- Analyse van een grote hoeveelheid genen
- Verschillende platformen: cDNA-microarrays en oligonucleotide-microarrays
- Backgroundproblemen: bij gebruik van microarrays kunnen achtergrondsignalen optreden door niet-specifieke
bindingen of fluorescerende ruis
- Relatieve signaalintensiteit: signaal op microarray gedetecteerd, is altijd relatief ten opzichte van andere
signalen op dezelfde chip => expressieniveaus bepaald door vergelijking van intensiteiten van andere spots
- Bioinformatica is essentieel voor het analyseren van enorme hoeveelheden data die door microarrays worden
geproduceerd, zijn krachtige bioinformatica-tools en methoden vereist
→ 1-Kleur vs. 2-Kleuren Microarrays:
- 1-Kleur: cDNA van elk sample apart gelabeld met enkele fluorescerende kleur (groene of rode fluorochroom)
en op afzonderlijke microarrays gehybridiseerd -> signaalintensiteit van spots op array gemeten om expressie
van elk gen in sample vast te stellen => eenvoudiger omdat elke array één sample vertegenwoordigt =>
• Voordelen: minder kans op kleur-bias, makkelijker te normaliseren en te analyseren
• Nadelen: vereist meer arrays om meerdere samples te vergelijken => hogere kosten
- 2-Kleuren: twee verschillende samples gelabeld met twee verschillende fluorescerende kleuren (Cy3 voor
groen en Cy5 voor rood) en samen op dezelfde array gehybridiseer -> relatieve expressie van genen tussen de
twee samples wordt gemeten door de intensiteit van de twee kleuren te vergelijken.
• Voordelen: ideaal voor directe vergelijking van genexpressie tussen twee condities, gebruik van
dezelfde array vermindert technische variaties tussen de samples.
• Nadelen: kleur-bias kan optreden -> één kleur consistent sterker/zwakker, complexere
normalisatie en data-analyse nodig om verschillen in kleurgevoeligheid te corrigeren
3
, Northern blotting: specifieke RNA-moleculen in mengsel detecteren en analyseren => bestuderen van genexpressie en
kan worden gebruikt om de hoeveelheid en grootte van RNA-moleculen te bepalen
1. Isolatie van RNA: RNA geëxtraheerd uit cellen of weefsels via chemische methoden/commerciële kits
2. Scheiden van RNA-moleculen: geïsoleerde RNA gescheiden op basis van grootte via gel-elektroforese
3. Overdracht naar een membraan: RNA-moleculen overgebracht (gebloot) naar nylon- of nitrocellulose-
membraan -> door capillaire overdracht of elektroforese-overdracht
4. Fixatie van RNA op het membraan: RNA permanent aan membraan gebonden -> door UV-licht/verhitting
5. Hybridisatie met een specifieke probe: gelabelde nucleotidenprobe die complementair is aan doel-RNA
gebruikt om specifieke RNA te detecteren -> probe kan radioactief of niet-radioactief (fluorescerend) zijn
6. Wassen en detectie: membraan gewassen om ongebonden probe te verwijderen -> probe gebonden aan doel-
RNA gedetecteerd met via autoradiografie of detectiemechanisme, afhankelijk van type labeling van probe
Kenmerken van Northern Blotting:
- Zeer specifiek doordat het gebruik maakt van complementaire probe die alleen bindt aan het doel-RNA
- Semi-kwantitatief: intensiteit van bands geeft een indicatie van hoeveelheid RNA aanwezig
- Groottebepaling van RNA-moleculen
- Robuustheid: relatief betrouwbare techniek (wel arbeidsintensief en tijdrovend)
Next-generation sequencing (NGS): maakt gebruik "clustering" -> DNA-moleculen voor bereiden op sequencing
1. Library-preparatie: fragmenteren van DNA-materiaal tot kleinere stukjes en toevoegen van specifieke
adaptersequenties aan beide uiteinden van de fragmenten => adapters zorgen ervoor dat DNA-fragmenten
kunnen binden aan flowcell (het oppervlak waarop sequencing plaatsvindt).
2. Flowcell-binding: flowcell = glasplaatje bedekt met miljoenen korte oligonucleotiden die complementair zijn
aan adaptersequenties die aan DNA-fragmenten zijn gehecht
3. Clustering door "Bridge Amplification": clustering begint wanneer een enkel DNA-fragment zich bindt aan een
complementaire oligonucleotide op de flowcell -> gebonden fragment buigt om een "brug" te vormen en
hybridiseert het aan een andere complementaire oligonucleotide in de buurt op de flowcell -> DNA-
polymerase wordt gebruikt om complementaire streng te synthetiseren => dubbelstrengs DNA-molecuul ->
strengen denatureerd (gescheiden) zodat er twee enkelstrengs DNA-moleculen ontstaan -> proces herhaalt
zich meerdere keren => clusters van identieke kopieën van elk origineel DNA-fragment gevormd
4. Denaturatie en Strippen van Templates: oorspronkelijke DNA-strengen verwijderd, zodat er enkel
complementaire kopieën op de flowcell achterblijven
Sequencing by Synthesis:
1. Toevoegen van Fluorescerende Nucleotiden: enkelstrengs DNA-templates in flowcell gebruikt -> tijdens
sequencingcyclus worden vier soorten nucleotiden (A, T, C, G) toegevoegd -> allemaal specifieke
fluorescerende groep en reversibele terminatorgroep bevatten => elk nucleotide gemodificeerd met specifieke
kleur die het onderscheidt van de andere drie basen.
2. Incorporatie van Nucleotiden: DNA-polymerase voegt complementair nucleotide toe aan groeiende streng als
er een match is met de sjabloon -> door aanwezigheid van terminatorgroep wordt telkens slechts één
nucleotide aan streng toegevoegd en stopt de synthese tijdelijk na elke toevoeging
3. Beeldvorming (Image is Taken): na toevoeging van nucleotiden wordt flowcell belicht en hoge-resolutie
afbeelding gemaakt van hele flowcell => eelke cluster op flowcell zendt licht uit met specifieke kleur die
overeenkomt met de ingebouwde nucleotide => bepalen welke nucleotide is toegevoegd op elke positie
4. Verwijderen van de Terminatorgroep (Terminator Group is Removed): terminatorgroep chemisch verwijderd
=> mogelijk dat volgende nucleotide kan worden ingebouwd in volgende cyclus.
5. Verwijderen van de Fluorescerende Groep (Fluorescent Group is Removed): fluorescerende groep aan
nucleotide gekoppeld verwijderd => om te voorkomen dat signaal van eerdere cyclus interfereert met signalen
van volgende cycli
RNA-sequencing (RNA-seq): krachtige techniek voor analyseren van het transcriptoom, of verzameling van alle RNA-
moleculen die in cel worden uitgedrukt
- RNA van cellen of weefsels omgezet in complementair DNA (cDNA) via reverse transcriptie -> gefragmenteerd
in korte stukjes -> geamplificeerd -> gesekveneerd via next-generation sequencing (NGS)-platforms zoals
Illumina=> massale parallelle sequencing van miljoenen korte cDNA-segmenten.
• Informatica om reads te mappen: resulterende korte sequenties, bekend als "reads", worden met bio-
informatica-software gemapt op referentiegenoom => helpt bij identificeren van genen of genregio's
Voordelen van RNA-seq ten opzichte van microarrays:
→ Niet gelimiteerd tot genomische sequenties: RNA-seq kan de novo transcripten detecteren, zelfs van organismen
waarvoor geen referentiegenoom beschikbaar is => veelzijdige techniek voor onderzoeken van nieuwe of weinig
bestudeerde soorten
→ Geen specie-specifieke probes nodig: RNA-seq kan elk RNA-transcript detecteren => geen voorafgaande kennis nodig
4
Hoorcolleges
HOC 1 - Introductie tot NCBI/Ensembl
Databank = (electronisch) archief met informatie
NCBI = National Center for Biotechnology Information
ENCEMBL = Ensembl-genoomdatabaseproject = genoombrowsers met genetische en moleculaire informatie over het
menselijk genoom, alsook van andere diersoorten/modelorganismen
Accession number = toegangsnummer = uniek nummer toegekend aan een volledig document wanneer
een sequentie wordt gedeponeerd in een databank
Geninfo nummer = gen indentifier = worden toegekend door NCBI aan elke nieuwe sequentie die in de
ENTREZ database komt
Reference Sequence (RefSeq) = openbare databank -> bevat gestandaardiseerde, nauwkeurig geannoteerde referentie-
DNA-, RNA- en eiwitsequenties voor verschillende organismen
Locus = naam
Eiwit-databanken
→ SWISS-PROT(EUR): biedt annotaties op hoog niveau, inclusief beschrijvingen van de domeinen, functie; verbonden
met veel bronnen
→ TrEMBL (Vertaald EMBL; EUR): bevat vertalingen van alle coderende sequenties in EMBL
→ PIR (Protein Identification Resource; VS)
→ GENPEPT (VS): (VS) afgeleid van automatische GenBank vertalingen van coderende sequenties
→ Uniprot= Swiss-prot + TrEMBL
HOC 2 - NCBI advanced
OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) = uitgebreide, openbare database die informatie bevat over menselijke
genen en genetische aandoeningen -> richt zich op de relatie tussen genen en erfelijke ziektes en beschrijft de
genetische basis van verschillende aandoeningen, symptomen, overervingspatronen en soms behandelingsopties
OMIM entry statistics
- Asterisk (*): gen beschrijving met bekende sequentie
- Een nummer symbool (#): beschrijvende entry, meestal van een fenotype (geen unieke locus). De reden is
meestal gegeven
- Een plus teken (+): beschrijving van een gen met bekende sequentie en phenotype
- Een procent teken (%): beschrijving van een bevestigde medeliaanse erfelijkheid of phenotypische locus maar
waarvan het onderliggende moleculaire mechanisme niet bekend is
- Geen symbool: de mendeliaanse link is niet echt bewezen
- Table view: overzicht van allee bekende mutaties -> je kan via hier ook de klinische varianten vinden
PDB = Protein Data Bank
HOC 3 - Blast
BLAST = Basic Local Alignment Search Tool
-> Homologe regio’s tussen biologische AZ/NZ seq vinden, nucl/eiw sequenties vgl met seq uit de database en op basis
hiervan de statistische significantie berekenen
Wanneer heb ik een BLAST nodig?
- Als ik PCR primer wil vinden die specifiek zijn
- Identificatie van onbekend stuk nucleotide sequentie (blastn) in nucleinezuur databank
- Opzoek naar family member (blastp) -> aminozuursequentie zoeken in eiwit databank
- Opzoek naar hetzelfde eiwit in een andere soort (blastp) -> aminozuursequentie zoeken in eiwit databank
- Opzoek naar eiwitten met gelijkaardige domeinen (blastp) -> aminozuursequentie zoeken in eiwit databank
- Twee sequenties met elkaar vergelijken; mutaties (blastp/n)
Blastx -> vertaalde nucleinezuursequentie zoeken in eiwit databank
Tblastn -> aminozuursequentie zoeken in vertaalde nucleinezuursequentie databank
Tblastx -> vertaalde nucleinezuursequentie in vertaalde nucleinezuursequentie databank
→ Needleman en Wunsch: beschouwt gelijkenis over de volledige omvang van de sequenties
→ Smith – Waterman: richt zich op regio's van gelijkenis in delen van de sequences
1
,Welke blast: Zoek seq: Databank:
N: NZ seq NZen
P: AZ seq Eiwitten
X: Vertaalde NZ seq Eiwit
t-N: AZ seq Vertaalde NZ seq
t-X: Vertaalde NZ seq Vertaalde NZ seq
BLAST: filtering van regio’s met lage complexiteit
- Poly A staart
- Lange herhalingen van één NT of AZ
- Patroon van NT of AZ
- Coiled coil domeinen
- Zure AZ rijke gebieden
- Repetitief genomisch DNA
-> Worden uitgefilterd uit de zoeksequentie vooraleer een BLAST zoekopdracht wordt uitgevoerd
BLAST Statistics : cut-off value E (S ≥ x) = m*n*K*e- λ*x
- E = expect value = aantal keren dat een score gelijk/hoger dan x zal worden bereikt door toeval als we een
zoekopdracht uitvoeren met een gegeven query sequentie in een databank met totale lengte N
- m = sequentie lengte van de query
- n = totale lengte van de databank
- K and λ = parameters die afhankelijk zijn van « extreme value » distributie die ontstaat door met een gegeven
query sequentie te zoeken in een databank
- De « extreme value » distributie is uiteraard ook afhankelijk van de scoringsmatrix die men gebruikt heeft
Expected Value (E-waarde):
o Het aantal keren dat een score gelijk aan of hoger dan x zal worden bereikt door toeval als we een
zoekopdracht uitvoeren met een gegeven query sequentie in een databank met totale lengte N
-> Hoe kleiner, hoe beter
Max/totale score = berekende waarde a/d hand van gaps, deletie/inserties
Query coverage = percentage gelijk
HOC 4 - VNTI
Kloneren van genen -> mRNA uithalen -> cDNA integreren in plasmide -> veel kopies van gen
=> Functie achterhalen van een eiwit door overexpressie van eiwit in cellen / lokalisatie van eiwit in cel…
→ Reguleren van gen/eiwit
VNTI: sequenties beheren en analyseren + primers maken/beheren
-> Molecule viewer: toegang tot database (lijst meet genen), display set up, primer design
-> Local database
-> Sequence alignment tools
-> Primer
- Altijd 2 primers nodig en nooit op dezelfde strand
- Ongeveer de dezelfde annealing temperatuur
- Bepaald door lengte en GC content (tm = 4°C)
Blast2seq = alignX in VNTI
AllignX: Download 2 seq in NCBI => zet in database VNTI => open in VNTI met alignX => selecteer 2 seq in linker box =>
klik align sequences in bovenste kolom => bij een ruimte in rechterbox => kijken in seq waar er geen match is =>
screenshot
Voor distance tree in allignX: komt vanzelf bij meer dan 2 seq
Graphical display viewer: open 2 seq in VNTI => window => future map (linker box) => exonen => kijken welke bp
verschillen => dit exon is verschillend (bovenbalk drukken) => 2 seq op gelijke hoogte zetten => screenshot hele pagina!
Primers specifiek: highlight exon dat verschilt OF stukje dat niet gelijk is in AllignX => primerdisign (bovenbalk) => PCR
primers inside selection => ok => screenshot analyseventer (ook 3 boxen geven!) => weergeven in seq => voeg primer
toe aan oligolist (bovenbalk) => displaysetup (bovenbalk) => motief (add oligolist) => sequence setup (3) => ok =>
screenshot (highligt primers met stukje ertss + fwd op bovenstreng en rev onderstreng!) 100% is goed; 60% is niet
specifiek
2
,Alignment van 2 identieke sequenties, toch ontstaan 2 verschillende ketens
Of praktische vraag: 2 labo's, 1 gelijke DNA-sequentie, toch verschil AZ-sequentie vanaf AZ60. Hoe komt dit?
Dit komt door een frame shift: Bij dit type mutatie wordt het leesraam verschoven (er ontstaan hierdoor verschillende
codons). Het eiwit zal vanaf deze mutatie geheel veranderd zijn en evt geen functie meer kunnen vervullen. Dit kan
door een deletie/insertie
HOC 5
PCR: Polymerase Chain Reaction => meten van genexpressie
1. RNA-isolatie + Reverse Transcriptase-reactie: RNA geïsoleerd uit een monster -> RNA omgezet in
complementair DNA (cDNA) door reverse transcriptase-reactie -> cDNA is nodig als template voor PCR
2. PCR-amplificatie: gen-specifieke primers gebruiken om specifieke genen van interesse te amplificeren -> PCR-
machine (thermocycler) wordt gebruikt om cDNA te vermeerderen door cyclische temperatuurveranderingen
3. Agarosegel-electroforese: producten van PCR op agarosegel geplaatst om gescheiden te worden op basis van
grootte -> gel bevat kleurstof (ethidiumbromide) waarmee DNA-banden zichtbaar worden onder UV-licht
Kenmerken van deze methode:
- Niet arbeidsintensief, relatief eenvoudig
- Gel nodig voor visualisatie
- Kleine hoeveelheid RNA is nodig om cDNA te maken
- Semi-kwantitatief: resultaten geven schatting van genexpressieniveaus, maar zijn niet volledig kwantitatief
- Makkelijker om meerdere genen te testen
Kwantitatieve PCR (qPCR): PCR-machine detecteert amplificatie in real-time via fluorescentiesignaal => toename van
PCR-product tijdens elke cyclus worden gemeten => qPCR zeer nauwkeurigere en kwantitatievere data
Microarrays: krachtige techniek om expressieniveaus van duizenden genen tegelijkertijd te meten => grootschalige
genexpressiepatronen analyseren en vergelijken tussen verschillende celtypes of experimentele omstandigheden.
-> Microarrays = chips die duizenden DNA-probes bevatten die complementair zijn aan sequenties van genen die men
wil onderzoeken -> door gemerkt cDNA of RNA van monster op chip aan te brengen, kan men zien welke genen tot
expressie komen en in welke mate
1. RNA-extractie
2. Omzetting naar cDNA en labelen: RNA omgezet in complementair DNA (cDNA) via reverse transcriptase -> ook
gelabeld met fluorescerende/radioactieve markers zodat het gedetecteerd kan worden na hybridisatie
3. Hybridisatie op de microarray: gelabelde cDNA aangebracht op microarray-chip en hybridiseert met de DNA-
probes die aan de chip zijn gebonden
4. Wassen en detectie: chip gewassen om ongebonden of niet-specifiek gebonden cDNA te verwijderen -> chip
gescand met laser om fluorescerende signalen te detecteren en te meten.
5. Data-analyse: verkregen data geanalyseerd via bioinformatica-tools -> normalisatie van signalen en relatieve
vergelijking van expressie van verschillende genen op chip -> output is genexpressieprofiel dat laat zien welke
genen meer of minder tot expressie komen in het onderzochte monster
Kenmerken van genexpressieprofilering met microarrays:
- Analyse van een grote hoeveelheid genen
- Verschillende platformen: cDNA-microarrays en oligonucleotide-microarrays
- Backgroundproblemen: bij gebruik van microarrays kunnen achtergrondsignalen optreden door niet-specifieke
bindingen of fluorescerende ruis
- Relatieve signaalintensiteit: signaal op microarray gedetecteerd, is altijd relatief ten opzichte van andere
signalen op dezelfde chip => expressieniveaus bepaald door vergelijking van intensiteiten van andere spots
- Bioinformatica is essentieel voor het analyseren van enorme hoeveelheden data die door microarrays worden
geproduceerd, zijn krachtige bioinformatica-tools en methoden vereist
→ 1-Kleur vs. 2-Kleuren Microarrays:
- 1-Kleur: cDNA van elk sample apart gelabeld met enkele fluorescerende kleur (groene of rode fluorochroom)
en op afzonderlijke microarrays gehybridiseerd -> signaalintensiteit van spots op array gemeten om expressie
van elk gen in sample vast te stellen => eenvoudiger omdat elke array één sample vertegenwoordigt =>
• Voordelen: minder kans op kleur-bias, makkelijker te normaliseren en te analyseren
• Nadelen: vereist meer arrays om meerdere samples te vergelijken => hogere kosten
- 2-Kleuren: twee verschillende samples gelabeld met twee verschillende fluorescerende kleuren (Cy3 voor
groen en Cy5 voor rood) en samen op dezelfde array gehybridiseer -> relatieve expressie van genen tussen de
twee samples wordt gemeten door de intensiteit van de twee kleuren te vergelijken.
• Voordelen: ideaal voor directe vergelijking van genexpressie tussen twee condities, gebruik van
dezelfde array vermindert technische variaties tussen de samples.
• Nadelen: kleur-bias kan optreden -> één kleur consistent sterker/zwakker, complexere
normalisatie en data-analyse nodig om verschillen in kleurgevoeligheid te corrigeren
3
, Northern blotting: specifieke RNA-moleculen in mengsel detecteren en analyseren => bestuderen van genexpressie en
kan worden gebruikt om de hoeveelheid en grootte van RNA-moleculen te bepalen
1. Isolatie van RNA: RNA geëxtraheerd uit cellen of weefsels via chemische methoden/commerciële kits
2. Scheiden van RNA-moleculen: geïsoleerde RNA gescheiden op basis van grootte via gel-elektroforese
3. Overdracht naar een membraan: RNA-moleculen overgebracht (gebloot) naar nylon- of nitrocellulose-
membraan -> door capillaire overdracht of elektroforese-overdracht
4. Fixatie van RNA op het membraan: RNA permanent aan membraan gebonden -> door UV-licht/verhitting
5. Hybridisatie met een specifieke probe: gelabelde nucleotidenprobe die complementair is aan doel-RNA
gebruikt om specifieke RNA te detecteren -> probe kan radioactief of niet-radioactief (fluorescerend) zijn
6. Wassen en detectie: membraan gewassen om ongebonden probe te verwijderen -> probe gebonden aan doel-
RNA gedetecteerd met via autoradiografie of detectiemechanisme, afhankelijk van type labeling van probe
Kenmerken van Northern Blotting:
- Zeer specifiek doordat het gebruik maakt van complementaire probe die alleen bindt aan het doel-RNA
- Semi-kwantitatief: intensiteit van bands geeft een indicatie van hoeveelheid RNA aanwezig
- Groottebepaling van RNA-moleculen
- Robuustheid: relatief betrouwbare techniek (wel arbeidsintensief en tijdrovend)
Next-generation sequencing (NGS): maakt gebruik "clustering" -> DNA-moleculen voor bereiden op sequencing
1. Library-preparatie: fragmenteren van DNA-materiaal tot kleinere stukjes en toevoegen van specifieke
adaptersequenties aan beide uiteinden van de fragmenten => adapters zorgen ervoor dat DNA-fragmenten
kunnen binden aan flowcell (het oppervlak waarop sequencing plaatsvindt).
2. Flowcell-binding: flowcell = glasplaatje bedekt met miljoenen korte oligonucleotiden die complementair zijn
aan adaptersequenties die aan DNA-fragmenten zijn gehecht
3. Clustering door "Bridge Amplification": clustering begint wanneer een enkel DNA-fragment zich bindt aan een
complementaire oligonucleotide op de flowcell -> gebonden fragment buigt om een "brug" te vormen en
hybridiseert het aan een andere complementaire oligonucleotide in de buurt op de flowcell -> DNA-
polymerase wordt gebruikt om complementaire streng te synthetiseren => dubbelstrengs DNA-molecuul ->
strengen denatureerd (gescheiden) zodat er twee enkelstrengs DNA-moleculen ontstaan -> proces herhaalt
zich meerdere keren => clusters van identieke kopieën van elk origineel DNA-fragment gevormd
4. Denaturatie en Strippen van Templates: oorspronkelijke DNA-strengen verwijderd, zodat er enkel
complementaire kopieën op de flowcell achterblijven
Sequencing by Synthesis:
1. Toevoegen van Fluorescerende Nucleotiden: enkelstrengs DNA-templates in flowcell gebruikt -> tijdens
sequencingcyclus worden vier soorten nucleotiden (A, T, C, G) toegevoegd -> allemaal specifieke
fluorescerende groep en reversibele terminatorgroep bevatten => elk nucleotide gemodificeerd met specifieke
kleur die het onderscheidt van de andere drie basen.
2. Incorporatie van Nucleotiden: DNA-polymerase voegt complementair nucleotide toe aan groeiende streng als
er een match is met de sjabloon -> door aanwezigheid van terminatorgroep wordt telkens slechts één
nucleotide aan streng toegevoegd en stopt de synthese tijdelijk na elke toevoeging
3. Beeldvorming (Image is Taken): na toevoeging van nucleotiden wordt flowcell belicht en hoge-resolutie
afbeelding gemaakt van hele flowcell => eelke cluster op flowcell zendt licht uit met specifieke kleur die
overeenkomt met de ingebouwde nucleotide => bepalen welke nucleotide is toegevoegd op elke positie
4. Verwijderen van de Terminatorgroep (Terminator Group is Removed): terminatorgroep chemisch verwijderd
=> mogelijk dat volgende nucleotide kan worden ingebouwd in volgende cyclus.
5. Verwijderen van de Fluorescerende Groep (Fluorescent Group is Removed): fluorescerende groep aan
nucleotide gekoppeld verwijderd => om te voorkomen dat signaal van eerdere cyclus interfereert met signalen
van volgende cycli
RNA-sequencing (RNA-seq): krachtige techniek voor analyseren van het transcriptoom, of verzameling van alle RNA-
moleculen die in cel worden uitgedrukt
- RNA van cellen of weefsels omgezet in complementair DNA (cDNA) via reverse transcriptie -> gefragmenteerd
in korte stukjes -> geamplificeerd -> gesekveneerd via next-generation sequencing (NGS)-platforms zoals
Illumina=> massale parallelle sequencing van miljoenen korte cDNA-segmenten.
• Informatica om reads te mappen: resulterende korte sequenties, bekend als "reads", worden met bio-
informatica-software gemapt op referentiegenoom => helpt bij identificeren van genen of genregio's
Voordelen van RNA-seq ten opzichte van microarrays:
→ Niet gelimiteerd tot genomische sequenties: RNA-seq kan de novo transcripten detecteren, zelfs van organismen
waarvoor geen referentiegenoom beschikbaar is => veelzijdige techniek voor onderzoeken van nieuwe of weinig
bestudeerde soorten
→ Geen specie-specifieke probes nodig: RNA-seq kan elk RNA-transcript detecteren => geen voorafgaande kennis nodig
4
