Experimentele en Cellulaire Moleculaire Biologie III
Genexpressie: (her)programmeren van cellen
Procesontwikkeling = cellen van een fase 1 naar een fase 2
Regeneratie = als cellen van een celtype naar een ander overgaan
Verwachting: beenmergcellen zijn zeer plastisch -> als je deze in een bepaalde micro-omgeving
plaatst, kunnen ze differentieren tot cellen uit die micro-omgeving
Waarneming: beenmergcellen differentieren niet naar een ander celtype, maar fusioneren met
andere cellen en nemen de genexpressiepatronen over
1. Cardiotoxine aan een muis toe dienen om spiercellen aan te tasten -> gemanipuleerde
beenmergcellen (hebben specifieke promotor met Lac Z erachter) injecteren ->
integreren aan de spieren -> als het genoom van de beenmergcellen cellen in de spier-
omgeving terecht komt dan gaat de specifieke promotor geactiveerd worden (ook al
differentieren de beenmergcellen niet) => Lac Z wordt getranslateerd => beta
galactosidase wordt geproduceerd => waarneembaar door kleurreactie
2. Beenmergcellen worden gemanipuleerd maar deze keer wordt een algemene promotor
gebruikt (afkomstig van huishoudsgen (actine)) met daarachter het gen voor green
fluorescent protein (GFP) => beenmerg-cellen kunnen gevolgd worden in elk weefsel =>
GFP gehalte analyseren
3. In een beschadigde lever mankeert een bepaalde stof -> als men dan beenmergcellen
injecteren gaan deze fusioneren en onder invloed van die micro-omgeving de specifieke
stof, die ontbreekt, produceren
-> Andere manier om cellen makkelijk te traceren is door mannelijke beenmergcellen te
injecteren in een vrouwelijke muis
Genen voor ontwikkeling, differentiatie en regeneratie:
Concept 1: ontwikkeling = link tussen genotype en fenotype -> blootstelling aan omgeving =>
epigenoom verandert
Concept 2: Kerngenen worden niet verloren of gemuteerd tijdens de ontwikkeling:
Exp.: kern van blastula van kikker in oocyten getransporteerd => kunnen uitgroeien naar kikkers
- Hoe vroeger tijdens ontwikkeling je een kern uit een cel extraheert en in een kernloze eicel
implanteert, hoe groter het percentage geslaagde klonen // hoe later, hoe moeilijker om
cellen volledig te herprogrammeren
- Induced pluripotent stem cells maak je door bepaalde combinaties van
transcriptiefactoren in volwassene cellen te brengen, zodat deze geherprogrammeerd
kunnen worden
=> Genoom van alle cellen is equivalent met uitzondering van dat van de witte bloedcellen die
aan herschikking van het DNA doen om zo te zorgen voor de aanmaak van verschillende
antilichamen en antigenreceptoren
Concept 3: Principe van genomische equivalentie toegepast bij:
- Metaplasie/transdifferentiatie: ene gedifferentieerd celtype wordt een ander
VB.: salamander: dorsale iris wordt ooglens als lens verwijderd wordt
VB.: Barret’s slokdarm: meerlagig plaveiselepitheel van slokdarm wordt kolomepitheel dat
lijkt op dat van de maag en darm als aanpassing aan chronische blootstelling aan zuur als
gevolg van reflux (chronische inflammatie) => pre-maligne conditie geassocieerd met
verhoogd risico op slokdarmkanker
Transdifferentiatie aantonen door de thymus van een groene rat (GFP uitgedrukt) om te
zetten naar enkelvoudige cellen -> in cultuur laten groeien -> transplanteren in de huid
van de muis => in deze micro- omgeving worden thymuscellen omgezet naar huidcellen
(gereprogrammeerd door micro-omgeving) => er ontstaan groene huidcellen -> om na te
gaan of de cellen wel gedifferentieerd zijn en niet gefuseerd zijn, gaat men rat en
muiscellen fluorescent kleuren en dan zien of er overlapping (gele kleur) is of niet.
- Ontwikkeling van volledige volwassene organismen uit de kern van een gedifferentieerde
cel:
Doel: nagaan of olfactorische sensorische neuronen (OSN's) volledig gedifferentieerd zijn
en hoe deze cellen zich verhouden tot precursorcellen en prolifererende cellen in de
olfactorische epitheellaag
GFP-expressie in gedifferentieerde cellen: construct werd ingebracht met
een LoxP-geflankeerd gen (β-Geo + stopcodons) tussen de β-Actin promotor en
GFP -> onder normale omstandigheden wordt GFP niet tot expressie gebracht
omdat het gen te lang is en stopcodons bevat => Cre recombinase onder controle
1
, van OMP-promotor (olfactory marker protein, enkel actief in mature OSN's) => wanneer
Cre recombinase aanwezig is, knipt het het tussenliggende segment uit => GFP tot
expressie in mature OSN’s
Bevestiging van maturiteit van GFP-positieve cellen
- MASH1 (marker voor basale precursorcellen) wordt in een lagere cellaag gevonden
=> deze voorlopercellen zijn nog niet mature OSN's
- BrdU-labeling (marker voor delende/prolifererende door inbouw in DNA tijdens de
S-fase) wordt in diepere lagen gevonden => deze voorlopercellen zijn nog niet
mature OSN's
- Ki67 (marker voor actief delende cellen) wordt in dezelfde laag als BrdU-positieve
cellen gevonden
=> Interpretatie van de resultaten:
- GFP-expressie beperkt tot de meest mature cellen in de bovenste lagen => deze
cellen delen niet meer en zijn terminaal gedifferentieerd
- Cre-expressie komt voor in een lagere laag dan de GFP-positieve cellen => cellen
die Cre-expressie beginnen te vertonen nog tijd nodig hebben om het floxed
segment uit te knippen en GFP tot expressie te brengen
- Er zijn meer BrdU-positieve cellen dan Ki67-positieve cellen, omdat BrdU
accumuleert na meerdere celcycli, terwijl Ki67 een momentopname is van actief
delende cellen.
De kern van GFP-positieve OSN’s wordt geïsoleerd en geïnjecteerd in een kernloze oöcyt,
waarna de gereconstrueerde oöcyt zich ontwikkelt tot een blastocyst -> hieruit worden
embryonale stamcellen (ES-cellen) afgeleid, die vervolgens worden geïnjecteerd in een
tetraploïde blastocyst => tetraploïde embryo gecreëerd door fusie van cellen in het twee-cellige
stadium met elektrische stroom -> dit embryo kan zich normaal implanteren in de
baarmoederwand, maar vormt voornamelijk extra-embryonaal weefsel en zelden een foetus ->
door ES-cellen afkomstig van GFP-positieve OSN-kernen in dit embryo te injecteren, krijgen deze
cellen voorrang bij de vorming van het embryo zelf -> als er een levensvatbaar organisme
ontstaat, betekent dit dat de OSN-kernen, ondanks hun gedifferentieerde staat, hun volledige
ontwikkelingspotentieel behouden ==> celtoestand is omkeerbaar
Concept 4: Kloneren van mensen, regeneratie beschadigde organen en verbetering van fysieke
mogelijkheden via klonerings-, ES en iPS cel technologie
Concept 5: Slechts een klein deel van het genoom wordt uitgedrukt in elke cel: verschillende
celtypen schrijven verschillende DNA regio’s over (northern blot, in situ hybridisatie, RT-PCR,
micro-array)
- RNA kan je isoleren door AGPC
- Specifiek mRNA amplificeren kan via oligo dT’s die de poly-A staart van mRNA herkennen
- DNase gebruikt om de amplificatie van DNA tegen te gaan, dit kan men ook bekomen door
intron-spanning amplicons te gebruiken (men gaat verschillende lengten detecteren op de
gel, DNA zal langer zijn dan RNA) of door poly dT primers te gebruiken
Polyteen chromosomen = kopies chromosomen die na replicatie naast elkaar blijven liggen
(cel deelt niet, chromosomen delen, genoom repliceert) => veel kopies (komen uit
speekselklieren Drosophila larve)
Concept 6: Studie genfunctie via gain- en loss of function (GoF en LoF) door transgene
uitdrukking en knock down
Concept 7: Genactiviteit in mens via kandidaat gen mapping (families waar veel personen
dezelfde ziekte hebben) of positioneel regio gaan kloneren
2
,Diabetes
De belangrijkste functie bij de mens van een beta cel is de productie van insuline: glucose wordt
opgenomen door glucose transporters en eenmaal glucose binnen in de cel is, wordt glucose
gefosforyleert
-> Algemeen wordt aanvaard dat er geen receptor is voor glucose en dus gebeurt het voelen van
glucose door de beta cel vooral door metabolisme van glucose: glycolyse gevolgd door krebs
cyclus => concentraties ADP en ATP stijgen => sluiting van het kaliumkanaal => depolarisatie
van de cel en calcium influx induceert
-> De opname van glucose door de cel heeft ook effecten op translationeel niveau: glucose kan
rechtstreeks bepaalde belangrijke eiwitten beïnvloeden waardoor er een effect is op de
transcriptie
=> Al dit gaat zorgen voor de vrijgave van insuline door de beta cel
Beta cellen zijn zowel de oorzaak als de oplossing van diabetes -> zijn in de pancreas gelegen en
zorgen voor de productie van insuline -> zorgt voor de aanmaak van energie door opname van
glucose door de cel te stimuleren
-> Wanneer de glucosehuishouding verstoord is door te kort aan insuline / resistentie spreekt
men van diabetes:
Diabetes type I: auto-immune afbraak van beta cellen waardoor te kort aan insuline ontstaat
Diabetes type 2: veroorzaakt door insuline resistentie waardoor de hoeveelheid insuline nodig
om tot aan een normaal effect te komen veel hoger is dan normaal (multifactoriële
ziekte)
Behandeling
Insuline zelf is geen therapie, maar een behandeling: neemt symptomen weg, maar het geneest
de ziekte niet helemaal -> insuline inspuiten en insulinepompen proberen de beta cellen na te
bootsen, maar er zullen nog altijd perioden zijn van hyperglycemie -> als er constant een te hoge
concentratie glucose is in het bloed dan gaan er ook eiwitten geglycosyleerd worden die dat
eigenlijk niet mogen => verstoort de functie van die eiwitten
-> Te weinig insuline kan dan weer zorgen voor hypoglycemie wat problemen ter hoogte van de
hersenen kan veroorzaken -> effecten merken aan de ogen, nieren, hart en vaatziekten en
problemen aan de extremiteiten (te weinig bloedtoevoer)
Transplantatie is misschien een oplossing, maar er is een tekort aan donororganen => men
moet dus op zoek naar nieuwe bronnen van beta cellen
In vitro probeert men beta cellen te laten prolifereren: proliferatie moet wel onder controle
gehouden worden, anders kan er te veel insuline geproduceerd worden of kanker ontstaan
Differentiatie van ES cellen of progenitor cellen en reprogrammatie zijn drie andere methoden
die kunnen gebruikt worden om het probleem op te lossen -> de cellen moeten gereprogrameerd
worden naar cellen uit het endoderm waarna differentiatie naar beta cellen kan gebeuren
Therapieën voor diabetes:
Doel: behoud en vervanging of herstel van de functionele beta cel massa om diabetes te genezen
=> beta cel transplantatie, verhindering van auto-immune aanval en programmeren van
stam/voorlopercellen tot therapeutische beta cel massa
-> De patiënt nieuwe beta cellen laten aanmaken zou de ideale oplossing zijn -> er zouden
facultatieve progenitor cellen zijn voor beta cellen, men heeft ductale cellen herkend als
progenitor cellen -> deze zouden wel aanwezig zijn, maar slapend of inactief zijn -> door in een
muis een deel van de pancreas af te snoeren en zo inflammatie te induceren ontstaat er een
nieuwe beta cel massa -> deze zijn natuurlijk niet identiek aan de normale cellen -> er zouden
ook signalen, cytokines, bestaan die de functionele beta cellen bewaren en herstellen in diabetes
-> Cytokines zijn moleculen die uitgescheiden worden door verschillende soorten lichaamscellen
op een continue manier of onder specifieke voorwaarden -> staan mede in voor controle van
ontstekingsreacties en immuun afweer, ontstaan van cellen in het embryo en herstelprocessen in
volwassen weefsels
-> Er is onderzoek geweest of de toediening van cytokines de hoeveelheid glucose deed dalen,
en in muizen was dat het geval, nu moest nog bekeken worden of er nieuwe beta cellen werden
gevormd of niet: door tal van beta cellen te labellen, de muis dan te behandelen met een toxine
dat veel beta cellen afbreekt en vervolgens cytokines toe te voegen en te gaan kijken naar de
cellen die insuline produceren
- Als deze cellen het reporter gen uitdrukken dan zijn ze afkomstig van de overlevende beta
cellen
- Als deze het reporter gen niet bevatten dan zijn ze afkomstig van andere cellen
3
, => Na de studie werd geconcludeerd dat de beta cellen niet zorgden voor de nieuwe insuline
toevoer
-> Hetzelfde onderzoek werd uitgevoerd met acinaire cellen onder invloed van cytokines ->
hieruit kon besloten worden dat acinaire cellen wel een grote bijdrage hadden => duct cellen
kunnen gereprogrammeerd worden naar beta cellen. GABA speelt een belangrijke vorm in de
differentiatie van alfa cellen naar alf beta en uiteindelijk naar beta cellen; en in de vernieuwing
van de alfa cel populatie.
Ontwikkeling en biologie van de beta cel
Na bevruchting van de eicel volgen er een heel aantal stappen om tot hun meest
gedifferentieerde vorm
-> Als je cellen uit de inner cell mass (ICM) van de blastocyst neemt dan kan je embryonale
stamcellen aanmaken
-> Beta cellen zijn afkomstig van het embryonair endoderm -> cel moet eerst beslissen of ze
ecto-, endo- of mesoderm wordt, daarna moet ze de lijn van een bepaald orgaan volgen
- Lijn van de pancreas volgen? Beslissen of ze deel van de endo- of exocriene pancreas
wordt
- Lijn van de endocriene pancreas? Beslissen welke soort cel het gaat worden
-> Hoe verder in het differentiatieproces, hoe minder proliferatief vermogen de cel heeft.
Endorderm formatie en gastrulatie
Gastrulatie: cruciale fase in de vroege embryonale ontwikkeling waarbij de drie kiemlagen
(ectoderm, mesoderm en endoderm) worden gevormd:
1. Epiblast - laag van ongedifferentieerde cellen wordt gevormd -> kunnen differentiëren tot
de drie kiemlagen: ectoderm, mesoderm en endoderm -> verdikking van de epiblast =
primitieve streep (PS)
2. Het visceraal endoderm ligt rond de epiblast en maakt deel uit van de extra-embryonale
structuren (structuren die later niet direct in het embryo blijven)
3. Migratie van cellen via de primitieve streep (vanaf dag E6):
- Endodermale en mesodermale precursorcellen migreren vanuit de epiblast via de
primitieve streep naar de achterzijde van het embryo
- Binnen 24 uur is de primitieve streep volledig gevormd en hebben de
mesodermcellen zich verspreid naar het mediale (midden) en laterale (zijkanten)
gebied tussen het endoderm en ectoderm -> bewegen ook naar voren (anterieur)
richting de toekomstige kop van het embryo
4. Interactie tussen kiemlagen en verdere differentiatie: embryonale endoderm mengt zich
met het visceraal endoderm (dooierzak) en strekt zich uit vanaf de primitieve streep tot
het neuraal ectoderm => embryonale endoderm komt dan in contact met andere
structuren langs de anterior-posterior as:
- Ectoderm (uiteindelijk huid en zenuwstelsel)
- Notochord (voorloper van de wervelkolom)
- Knop van Hensen (belangrijk bij de organisatie van de lichaamsas)
- Primitieve streep
5. Notochord precursorcellen migreren naar voren en vormen de notochord, een tijdelijke
structuur die dient als een soort ruggengraat -> de micro-omgeving waarin de cellen zich
bevinden, beïnvloedt hun beweging door middel van liganden die de richting van migratie
bepalen.
6. De drie kiemlagen (endoderm, mesoderm en ectoderm) zijn volledig gevormd
Regulerende factoren: regulatie en ontstaan van endoderm: proces is grotendeels onbekend -> er
zijn geen vroege, definitieve endoderm-specifieke merkers gekend
- Foxa2 en Sox17 - merkers voor definitief endoderm
- De primitieve streep en de knop van Heksen produceren groeifactoren die het lot van de
cel bepalen:
FGFR1: om na te gaan of FGFR1 een rol speelt over de beslissing van differentiatie naar endo-
of mesoderm, gaat men ES cellen gebruiken die een reportereiwit uitdrukken (bijvoorbeeld beta
galctosidase) en die nul mutant zijn voor FGFR1 => je neemt dus een stukje van het gen weg dat
instaat voor een belangrijke functie van die receptor, dit doe je door homologe recombinatie,
waarna je cel die receptor niet produceert, of alleszins geen functionele versie ervan -> door een
reporter gen te gebruiken, kan je de cel gaan volgen
- Reporter gen GFP gebruiken: levende cellen volgen
- Reporter gen beta galactosidase: er moet een stof toegediend worden opdat er een
gekleurd precipitaat ontstaat en daarvoor heb je dode cellen nodig
4
Genexpressie: (her)programmeren van cellen
Procesontwikkeling = cellen van een fase 1 naar een fase 2
Regeneratie = als cellen van een celtype naar een ander overgaan
Verwachting: beenmergcellen zijn zeer plastisch -> als je deze in een bepaalde micro-omgeving
plaatst, kunnen ze differentieren tot cellen uit die micro-omgeving
Waarneming: beenmergcellen differentieren niet naar een ander celtype, maar fusioneren met
andere cellen en nemen de genexpressiepatronen over
1. Cardiotoxine aan een muis toe dienen om spiercellen aan te tasten -> gemanipuleerde
beenmergcellen (hebben specifieke promotor met Lac Z erachter) injecteren ->
integreren aan de spieren -> als het genoom van de beenmergcellen cellen in de spier-
omgeving terecht komt dan gaat de specifieke promotor geactiveerd worden (ook al
differentieren de beenmergcellen niet) => Lac Z wordt getranslateerd => beta
galactosidase wordt geproduceerd => waarneembaar door kleurreactie
2. Beenmergcellen worden gemanipuleerd maar deze keer wordt een algemene promotor
gebruikt (afkomstig van huishoudsgen (actine)) met daarachter het gen voor green
fluorescent protein (GFP) => beenmerg-cellen kunnen gevolgd worden in elk weefsel =>
GFP gehalte analyseren
3. In een beschadigde lever mankeert een bepaalde stof -> als men dan beenmergcellen
injecteren gaan deze fusioneren en onder invloed van die micro-omgeving de specifieke
stof, die ontbreekt, produceren
-> Andere manier om cellen makkelijk te traceren is door mannelijke beenmergcellen te
injecteren in een vrouwelijke muis
Genen voor ontwikkeling, differentiatie en regeneratie:
Concept 1: ontwikkeling = link tussen genotype en fenotype -> blootstelling aan omgeving =>
epigenoom verandert
Concept 2: Kerngenen worden niet verloren of gemuteerd tijdens de ontwikkeling:
Exp.: kern van blastula van kikker in oocyten getransporteerd => kunnen uitgroeien naar kikkers
- Hoe vroeger tijdens ontwikkeling je een kern uit een cel extraheert en in een kernloze eicel
implanteert, hoe groter het percentage geslaagde klonen // hoe later, hoe moeilijker om
cellen volledig te herprogrammeren
- Induced pluripotent stem cells maak je door bepaalde combinaties van
transcriptiefactoren in volwassene cellen te brengen, zodat deze geherprogrammeerd
kunnen worden
=> Genoom van alle cellen is equivalent met uitzondering van dat van de witte bloedcellen die
aan herschikking van het DNA doen om zo te zorgen voor de aanmaak van verschillende
antilichamen en antigenreceptoren
Concept 3: Principe van genomische equivalentie toegepast bij:
- Metaplasie/transdifferentiatie: ene gedifferentieerd celtype wordt een ander
VB.: salamander: dorsale iris wordt ooglens als lens verwijderd wordt
VB.: Barret’s slokdarm: meerlagig plaveiselepitheel van slokdarm wordt kolomepitheel dat
lijkt op dat van de maag en darm als aanpassing aan chronische blootstelling aan zuur als
gevolg van reflux (chronische inflammatie) => pre-maligne conditie geassocieerd met
verhoogd risico op slokdarmkanker
Transdifferentiatie aantonen door de thymus van een groene rat (GFP uitgedrukt) om te
zetten naar enkelvoudige cellen -> in cultuur laten groeien -> transplanteren in de huid
van de muis => in deze micro- omgeving worden thymuscellen omgezet naar huidcellen
(gereprogrammeerd door micro-omgeving) => er ontstaan groene huidcellen -> om na te
gaan of de cellen wel gedifferentieerd zijn en niet gefuseerd zijn, gaat men rat en
muiscellen fluorescent kleuren en dan zien of er overlapping (gele kleur) is of niet.
- Ontwikkeling van volledige volwassene organismen uit de kern van een gedifferentieerde
cel:
Doel: nagaan of olfactorische sensorische neuronen (OSN's) volledig gedifferentieerd zijn
en hoe deze cellen zich verhouden tot precursorcellen en prolifererende cellen in de
olfactorische epitheellaag
GFP-expressie in gedifferentieerde cellen: construct werd ingebracht met
een LoxP-geflankeerd gen (β-Geo + stopcodons) tussen de β-Actin promotor en
GFP -> onder normale omstandigheden wordt GFP niet tot expressie gebracht
omdat het gen te lang is en stopcodons bevat => Cre recombinase onder controle
1
, van OMP-promotor (olfactory marker protein, enkel actief in mature OSN's) => wanneer
Cre recombinase aanwezig is, knipt het het tussenliggende segment uit => GFP tot
expressie in mature OSN’s
Bevestiging van maturiteit van GFP-positieve cellen
- MASH1 (marker voor basale precursorcellen) wordt in een lagere cellaag gevonden
=> deze voorlopercellen zijn nog niet mature OSN's
- BrdU-labeling (marker voor delende/prolifererende door inbouw in DNA tijdens de
S-fase) wordt in diepere lagen gevonden => deze voorlopercellen zijn nog niet
mature OSN's
- Ki67 (marker voor actief delende cellen) wordt in dezelfde laag als BrdU-positieve
cellen gevonden
=> Interpretatie van de resultaten:
- GFP-expressie beperkt tot de meest mature cellen in de bovenste lagen => deze
cellen delen niet meer en zijn terminaal gedifferentieerd
- Cre-expressie komt voor in een lagere laag dan de GFP-positieve cellen => cellen
die Cre-expressie beginnen te vertonen nog tijd nodig hebben om het floxed
segment uit te knippen en GFP tot expressie te brengen
- Er zijn meer BrdU-positieve cellen dan Ki67-positieve cellen, omdat BrdU
accumuleert na meerdere celcycli, terwijl Ki67 een momentopname is van actief
delende cellen.
De kern van GFP-positieve OSN’s wordt geïsoleerd en geïnjecteerd in een kernloze oöcyt,
waarna de gereconstrueerde oöcyt zich ontwikkelt tot een blastocyst -> hieruit worden
embryonale stamcellen (ES-cellen) afgeleid, die vervolgens worden geïnjecteerd in een
tetraploïde blastocyst => tetraploïde embryo gecreëerd door fusie van cellen in het twee-cellige
stadium met elektrische stroom -> dit embryo kan zich normaal implanteren in de
baarmoederwand, maar vormt voornamelijk extra-embryonaal weefsel en zelden een foetus ->
door ES-cellen afkomstig van GFP-positieve OSN-kernen in dit embryo te injecteren, krijgen deze
cellen voorrang bij de vorming van het embryo zelf -> als er een levensvatbaar organisme
ontstaat, betekent dit dat de OSN-kernen, ondanks hun gedifferentieerde staat, hun volledige
ontwikkelingspotentieel behouden ==> celtoestand is omkeerbaar
Concept 4: Kloneren van mensen, regeneratie beschadigde organen en verbetering van fysieke
mogelijkheden via klonerings-, ES en iPS cel technologie
Concept 5: Slechts een klein deel van het genoom wordt uitgedrukt in elke cel: verschillende
celtypen schrijven verschillende DNA regio’s over (northern blot, in situ hybridisatie, RT-PCR,
micro-array)
- RNA kan je isoleren door AGPC
- Specifiek mRNA amplificeren kan via oligo dT’s die de poly-A staart van mRNA herkennen
- DNase gebruikt om de amplificatie van DNA tegen te gaan, dit kan men ook bekomen door
intron-spanning amplicons te gebruiken (men gaat verschillende lengten detecteren op de
gel, DNA zal langer zijn dan RNA) of door poly dT primers te gebruiken
Polyteen chromosomen = kopies chromosomen die na replicatie naast elkaar blijven liggen
(cel deelt niet, chromosomen delen, genoom repliceert) => veel kopies (komen uit
speekselklieren Drosophila larve)
Concept 6: Studie genfunctie via gain- en loss of function (GoF en LoF) door transgene
uitdrukking en knock down
Concept 7: Genactiviteit in mens via kandidaat gen mapping (families waar veel personen
dezelfde ziekte hebben) of positioneel regio gaan kloneren
2
,Diabetes
De belangrijkste functie bij de mens van een beta cel is de productie van insuline: glucose wordt
opgenomen door glucose transporters en eenmaal glucose binnen in de cel is, wordt glucose
gefosforyleert
-> Algemeen wordt aanvaard dat er geen receptor is voor glucose en dus gebeurt het voelen van
glucose door de beta cel vooral door metabolisme van glucose: glycolyse gevolgd door krebs
cyclus => concentraties ADP en ATP stijgen => sluiting van het kaliumkanaal => depolarisatie
van de cel en calcium influx induceert
-> De opname van glucose door de cel heeft ook effecten op translationeel niveau: glucose kan
rechtstreeks bepaalde belangrijke eiwitten beïnvloeden waardoor er een effect is op de
transcriptie
=> Al dit gaat zorgen voor de vrijgave van insuline door de beta cel
Beta cellen zijn zowel de oorzaak als de oplossing van diabetes -> zijn in de pancreas gelegen en
zorgen voor de productie van insuline -> zorgt voor de aanmaak van energie door opname van
glucose door de cel te stimuleren
-> Wanneer de glucosehuishouding verstoord is door te kort aan insuline / resistentie spreekt
men van diabetes:
Diabetes type I: auto-immune afbraak van beta cellen waardoor te kort aan insuline ontstaat
Diabetes type 2: veroorzaakt door insuline resistentie waardoor de hoeveelheid insuline nodig
om tot aan een normaal effect te komen veel hoger is dan normaal (multifactoriële
ziekte)
Behandeling
Insuline zelf is geen therapie, maar een behandeling: neemt symptomen weg, maar het geneest
de ziekte niet helemaal -> insuline inspuiten en insulinepompen proberen de beta cellen na te
bootsen, maar er zullen nog altijd perioden zijn van hyperglycemie -> als er constant een te hoge
concentratie glucose is in het bloed dan gaan er ook eiwitten geglycosyleerd worden die dat
eigenlijk niet mogen => verstoort de functie van die eiwitten
-> Te weinig insuline kan dan weer zorgen voor hypoglycemie wat problemen ter hoogte van de
hersenen kan veroorzaken -> effecten merken aan de ogen, nieren, hart en vaatziekten en
problemen aan de extremiteiten (te weinig bloedtoevoer)
Transplantatie is misschien een oplossing, maar er is een tekort aan donororganen => men
moet dus op zoek naar nieuwe bronnen van beta cellen
In vitro probeert men beta cellen te laten prolifereren: proliferatie moet wel onder controle
gehouden worden, anders kan er te veel insuline geproduceerd worden of kanker ontstaan
Differentiatie van ES cellen of progenitor cellen en reprogrammatie zijn drie andere methoden
die kunnen gebruikt worden om het probleem op te lossen -> de cellen moeten gereprogrameerd
worden naar cellen uit het endoderm waarna differentiatie naar beta cellen kan gebeuren
Therapieën voor diabetes:
Doel: behoud en vervanging of herstel van de functionele beta cel massa om diabetes te genezen
=> beta cel transplantatie, verhindering van auto-immune aanval en programmeren van
stam/voorlopercellen tot therapeutische beta cel massa
-> De patiënt nieuwe beta cellen laten aanmaken zou de ideale oplossing zijn -> er zouden
facultatieve progenitor cellen zijn voor beta cellen, men heeft ductale cellen herkend als
progenitor cellen -> deze zouden wel aanwezig zijn, maar slapend of inactief zijn -> door in een
muis een deel van de pancreas af te snoeren en zo inflammatie te induceren ontstaat er een
nieuwe beta cel massa -> deze zijn natuurlijk niet identiek aan de normale cellen -> er zouden
ook signalen, cytokines, bestaan die de functionele beta cellen bewaren en herstellen in diabetes
-> Cytokines zijn moleculen die uitgescheiden worden door verschillende soorten lichaamscellen
op een continue manier of onder specifieke voorwaarden -> staan mede in voor controle van
ontstekingsreacties en immuun afweer, ontstaan van cellen in het embryo en herstelprocessen in
volwassen weefsels
-> Er is onderzoek geweest of de toediening van cytokines de hoeveelheid glucose deed dalen,
en in muizen was dat het geval, nu moest nog bekeken worden of er nieuwe beta cellen werden
gevormd of niet: door tal van beta cellen te labellen, de muis dan te behandelen met een toxine
dat veel beta cellen afbreekt en vervolgens cytokines toe te voegen en te gaan kijken naar de
cellen die insuline produceren
- Als deze cellen het reporter gen uitdrukken dan zijn ze afkomstig van de overlevende beta
cellen
- Als deze het reporter gen niet bevatten dan zijn ze afkomstig van andere cellen
3
, => Na de studie werd geconcludeerd dat de beta cellen niet zorgden voor de nieuwe insuline
toevoer
-> Hetzelfde onderzoek werd uitgevoerd met acinaire cellen onder invloed van cytokines ->
hieruit kon besloten worden dat acinaire cellen wel een grote bijdrage hadden => duct cellen
kunnen gereprogrammeerd worden naar beta cellen. GABA speelt een belangrijke vorm in de
differentiatie van alfa cellen naar alf beta en uiteindelijk naar beta cellen; en in de vernieuwing
van de alfa cel populatie.
Ontwikkeling en biologie van de beta cel
Na bevruchting van de eicel volgen er een heel aantal stappen om tot hun meest
gedifferentieerde vorm
-> Als je cellen uit de inner cell mass (ICM) van de blastocyst neemt dan kan je embryonale
stamcellen aanmaken
-> Beta cellen zijn afkomstig van het embryonair endoderm -> cel moet eerst beslissen of ze
ecto-, endo- of mesoderm wordt, daarna moet ze de lijn van een bepaald orgaan volgen
- Lijn van de pancreas volgen? Beslissen of ze deel van de endo- of exocriene pancreas
wordt
- Lijn van de endocriene pancreas? Beslissen welke soort cel het gaat worden
-> Hoe verder in het differentiatieproces, hoe minder proliferatief vermogen de cel heeft.
Endorderm formatie en gastrulatie
Gastrulatie: cruciale fase in de vroege embryonale ontwikkeling waarbij de drie kiemlagen
(ectoderm, mesoderm en endoderm) worden gevormd:
1. Epiblast - laag van ongedifferentieerde cellen wordt gevormd -> kunnen differentiëren tot
de drie kiemlagen: ectoderm, mesoderm en endoderm -> verdikking van de epiblast =
primitieve streep (PS)
2. Het visceraal endoderm ligt rond de epiblast en maakt deel uit van de extra-embryonale
structuren (structuren die later niet direct in het embryo blijven)
3. Migratie van cellen via de primitieve streep (vanaf dag E6):
- Endodermale en mesodermale precursorcellen migreren vanuit de epiblast via de
primitieve streep naar de achterzijde van het embryo
- Binnen 24 uur is de primitieve streep volledig gevormd en hebben de
mesodermcellen zich verspreid naar het mediale (midden) en laterale (zijkanten)
gebied tussen het endoderm en ectoderm -> bewegen ook naar voren (anterieur)
richting de toekomstige kop van het embryo
4. Interactie tussen kiemlagen en verdere differentiatie: embryonale endoderm mengt zich
met het visceraal endoderm (dooierzak) en strekt zich uit vanaf de primitieve streep tot
het neuraal ectoderm => embryonale endoderm komt dan in contact met andere
structuren langs de anterior-posterior as:
- Ectoderm (uiteindelijk huid en zenuwstelsel)
- Notochord (voorloper van de wervelkolom)
- Knop van Hensen (belangrijk bij de organisatie van de lichaamsas)
- Primitieve streep
5. Notochord precursorcellen migreren naar voren en vormen de notochord, een tijdelijke
structuur die dient als een soort ruggengraat -> de micro-omgeving waarin de cellen zich
bevinden, beïnvloedt hun beweging door middel van liganden die de richting van migratie
bepalen.
6. De drie kiemlagen (endoderm, mesoderm en ectoderm) zijn volledig gevormd
Regulerende factoren: regulatie en ontstaan van endoderm: proces is grotendeels onbekend -> er
zijn geen vroege, definitieve endoderm-specifieke merkers gekend
- Foxa2 en Sox17 - merkers voor definitief endoderm
- De primitieve streep en de knop van Heksen produceren groeifactoren die het lot van de
cel bepalen:
FGFR1: om na te gaan of FGFR1 een rol speelt over de beslissing van differentiatie naar endo-
of mesoderm, gaat men ES cellen gebruiken die een reportereiwit uitdrukken (bijvoorbeeld beta
galctosidase) en die nul mutant zijn voor FGFR1 => je neemt dus een stukje van het gen weg dat
instaat voor een belangrijke functie van die receptor, dit doe je door homologe recombinatie,
waarna je cel die receptor niet produceert, of alleszins geen functionele versie ervan -> door een
reporter gen te gebruiken, kan je de cel gaan volgen
- Reporter gen GFP gebruiken: levende cellen volgen
- Reporter gen beta galactosidase: er moet een stof toegediend worden opdat er een
gekleurd precipitaat ontstaat en daarvoor heb je dode cellen nodig
4
