Inhoudsopgave
Praktijken...............................................................................................................................................2
PT1: flowcytometrie...............................................................................................................................3
PT2: ELISA platen coaten/Lysaten maken.............................................................................................11
PT3: ELISA.............................................................................................................................................13
PT4 Western Blot (deel 1: blotting)......................................................................................................16
PT5 Western Blot (deel 2: detectie van eiwitten).................................................................................22
Bijlage 1: telling met behulp van de Bürker telkamer..................................................................23
1
, Praktijken
Onderzoeksvraag/probleemstelling bij de praktijklessen
Een onderzoeker heeft B- en T cellen geïsoleerd uit bloed. Hij heeft zijn buizen echter niet goed
gelabeld en weet niet meer welke cellen in welke buis zitten. Hij wil ook weten of de isolatie goed is
gegaan en hoe zuiver de cellen zijn. Onder de microscoop zien de cellen er hetzelfde uit. Er zal dus op
een andere manier moeten worden bepaald welke cellen in welke buis zitten. Tijdens deze praktijken
gaan jullie flowcytometrie, ELISA en Western Blot doen om:
(1) te achterhalen in welke buis de T cellen zitten en in welke buis de B cellen
(2) te bepalen of de isolatie van de cellen goed is gegaan.
Op de volgende pagina’s staat per praktijk beschreven wat er gedaan gaat worden.
2
, PT1: flowcytometrie
Een belangrijke techniek om eiwitexpressie door/van afzonderlijke cellen te bepalen is
flowcytometrie. Het principe van deze techniek wordt behandeld tijdens HC1 en WC1. Tijdens deze
praktijk met flowcytometrie achterhalen in welke buis de T cellen en B cellen zitten en of (de isolatie
goed is gegaan (heb je alleen T cellen/B cellen in de juiste buis zitten?). Voor dit experiment heb je
αCD3-FITC en αCD19-PE tot je beschikking.
Voorbereinde vragen voor de praktijk:
Welke van de beschikbare antilichamen zullen aan welke cellen binden? Stel op basis
hiervan een hypothese op voor dit experiment. Noteer deze in je labjournaal.
Antilichaam CD3-FITC zal binden aan T-cellen, antilichaam CD19-PE zal binden aan B-cellen.
Dus, de B-cellen zullen een gele kleur krijgen door de PE en de T-cellen zullen een groene kleur
krijgen door de FITC.
Wat zijn FITC en PE voor labels en wat is hun extinctie/emissie?
FITCExMax=490/EmMax=525
PEExMax=565/EmMax=578
Je maakt aan het begin van de praktijk 10 ml FACS-buffer. Bedenk van te voren hoe je dit
gaat maken: noteer de berekeningen en hoeveelheden in je labjournaal.
Zie berekening in methode
Welke kleuringen ga je doen om te kunnen achterhalen welke cellen in welke buis zitten?
Denk daarbij aan de controles en samples die nodig zijn voor het instellen van de FACS!
(zie ook HC1 en WC1).
Voor het instellen van de FACS is de controle een enkelkleuring met FITC & PE. Het sample wordt
gekleurd met FITS & PE, PE geeft dan een gele kleur en FITS geeft een groene kleur. Linksonder de
gate zitten ongekleurde cellen/dode cellen/ dellen die geen B of T-cellen zijn, ze zijn dubbelnegatief.
Rechtsonder komen de CD3 T-cellen, deze zijn dan +- geladen. Linksboven komen de CD 19 B-cellen,
deze zijn +- geladen alleen door het andere label gescheiden. Rechtsboven komen de ++ cellen, dit
zijn bijvoorbeeld cellen die geen B of T-cellen zijn.
Ongekleurd: 2 monsters samenvoegen (1xgaten)
1=A+B ongekleurd
2= A+B α-CD3-FITC
3= A+B α-CD19-PE
4= dubbelkleuring A α-CD3 FITC & α-CD19-PE
5= dubbelkleuring α-CD3-FITC & α-CD19-PE
Per kleuring/epje heb je 25µl antilichaamoplossing nodig. α-CD3-FITC moet uiteindelijk
1:50 zijn verdund in het epje bij de cellen en α-CD19-PE moet 1:25 zijn verdund.
Voorverdunning α-CD3-FITC 1:50
1. Eerst 5x verdunnen en vervolgens 10x de 5x verdunnen⇨ 4µl antilichaam in 16µl buffer
2. 10x verdunning van de 10x verdunning⇨ 2,5µl antilichaam (uit stap 1) in 22,5µl buffer.
Eindvolume is dan 25µl antilichaam
Voorverdunning α-CD19-PE à1:25
1. Eerst 5x verdunnen en vervolgens weer 5x
5x verdunning⇨4µl antilichaam in 16µl buffer
2. 5x verdunning⇨ 5µl antilichaam (uit stap 1, de 1e verdunning) in 20µl buffer.
3
Praktijken...............................................................................................................................................2
PT1: flowcytometrie...............................................................................................................................3
PT2: ELISA platen coaten/Lysaten maken.............................................................................................11
PT3: ELISA.............................................................................................................................................13
PT4 Western Blot (deel 1: blotting)......................................................................................................16
PT5 Western Blot (deel 2: detectie van eiwitten).................................................................................22
Bijlage 1: telling met behulp van de Bürker telkamer..................................................................23
1
, Praktijken
Onderzoeksvraag/probleemstelling bij de praktijklessen
Een onderzoeker heeft B- en T cellen geïsoleerd uit bloed. Hij heeft zijn buizen echter niet goed
gelabeld en weet niet meer welke cellen in welke buis zitten. Hij wil ook weten of de isolatie goed is
gegaan en hoe zuiver de cellen zijn. Onder de microscoop zien de cellen er hetzelfde uit. Er zal dus op
een andere manier moeten worden bepaald welke cellen in welke buis zitten. Tijdens deze praktijken
gaan jullie flowcytometrie, ELISA en Western Blot doen om:
(1) te achterhalen in welke buis de T cellen zitten en in welke buis de B cellen
(2) te bepalen of de isolatie van de cellen goed is gegaan.
Op de volgende pagina’s staat per praktijk beschreven wat er gedaan gaat worden.
2
, PT1: flowcytometrie
Een belangrijke techniek om eiwitexpressie door/van afzonderlijke cellen te bepalen is
flowcytometrie. Het principe van deze techniek wordt behandeld tijdens HC1 en WC1. Tijdens deze
praktijk met flowcytometrie achterhalen in welke buis de T cellen en B cellen zitten en of (de isolatie
goed is gegaan (heb je alleen T cellen/B cellen in de juiste buis zitten?). Voor dit experiment heb je
αCD3-FITC en αCD19-PE tot je beschikking.
Voorbereinde vragen voor de praktijk:
Welke van de beschikbare antilichamen zullen aan welke cellen binden? Stel op basis
hiervan een hypothese op voor dit experiment. Noteer deze in je labjournaal.
Antilichaam CD3-FITC zal binden aan T-cellen, antilichaam CD19-PE zal binden aan B-cellen.
Dus, de B-cellen zullen een gele kleur krijgen door de PE en de T-cellen zullen een groene kleur
krijgen door de FITC.
Wat zijn FITC en PE voor labels en wat is hun extinctie/emissie?
FITCExMax=490/EmMax=525
PEExMax=565/EmMax=578
Je maakt aan het begin van de praktijk 10 ml FACS-buffer. Bedenk van te voren hoe je dit
gaat maken: noteer de berekeningen en hoeveelheden in je labjournaal.
Zie berekening in methode
Welke kleuringen ga je doen om te kunnen achterhalen welke cellen in welke buis zitten?
Denk daarbij aan de controles en samples die nodig zijn voor het instellen van de FACS!
(zie ook HC1 en WC1).
Voor het instellen van de FACS is de controle een enkelkleuring met FITC & PE. Het sample wordt
gekleurd met FITS & PE, PE geeft dan een gele kleur en FITS geeft een groene kleur. Linksonder de
gate zitten ongekleurde cellen/dode cellen/ dellen die geen B of T-cellen zijn, ze zijn dubbelnegatief.
Rechtsonder komen de CD3 T-cellen, deze zijn dan +- geladen. Linksboven komen de CD 19 B-cellen,
deze zijn +- geladen alleen door het andere label gescheiden. Rechtsboven komen de ++ cellen, dit
zijn bijvoorbeeld cellen die geen B of T-cellen zijn.
Ongekleurd: 2 monsters samenvoegen (1xgaten)
1=A+B ongekleurd
2= A+B α-CD3-FITC
3= A+B α-CD19-PE
4= dubbelkleuring A α-CD3 FITC & α-CD19-PE
5= dubbelkleuring α-CD3-FITC & α-CD19-PE
Per kleuring/epje heb je 25µl antilichaamoplossing nodig. α-CD3-FITC moet uiteindelijk
1:50 zijn verdund in het epje bij de cellen en α-CD19-PE moet 1:25 zijn verdund.
Voorverdunning α-CD3-FITC 1:50
1. Eerst 5x verdunnen en vervolgens 10x de 5x verdunnen⇨ 4µl antilichaam in 16µl buffer
2. 10x verdunning van de 10x verdunning⇨ 2,5µl antilichaam (uit stap 1) in 22,5µl buffer.
Eindvolume is dan 25µl antilichaam
Voorverdunning α-CD19-PE à1:25
1. Eerst 5x verdunnen en vervolgens weer 5x
5x verdunning⇨4µl antilichaam in 16µl buffer
2. 5x verdunning⇨ 5µl antilichaam (uit stap 1, de 1e verdunning) in 20µl buffer.
3
