Samenvatting Biomethoden 1

Biomethoden les 1
Inleiding:
- Waarvoor staat RNA?
o Ribonucleïnezuur
- Hoe ziet een monomeer eruit?
o Enkelstreng, met een fosfaat een suiker en een base groep waarbij de U is vervangen
voor een T
- Welke soorten RNA zijn er?
o tRNA
o mRNA
o rRNA
- Waarom isoleer je RNA?
o Om de genexpressie te kunnen bepalen, dit kan door RNA te isoleren en om te zetten
naar cDNA.
▪ cDNA = complementary of copy DNA en bevat alleen exonen.
- Wat doet RNase?
Dit breekt RNA deeltjes af -> degradatie
DNA
Wordt gedaan door transcriptie, hierbij bevinden zich nog intronen en exonen
premRNA

mRNA
wordt gedaan door translatie
Eiwit

RNA processing:
- Splicing
- Poly A staart wordt geplaatst aan de 3’
- Aan de 5’ ontstaat een cap, dit is een gemodificeerd G nucleotide

Trizol/ribosol: wordt gebruikt voor het isoleren van RNA
- Dit zorgt ervoor dat het celmembraan kapot gaat, en dat het RNA niet wordt afgebroken
o Dit komt doordat het een zure pH heeft.
o Voor optimale controle altijd de pH checken
▪ Bij een neutrale pH zal deze stof niet goed zijn werking doen
• Controleren met pH papier
Chloroform: zorgt voor scheiding, hierdoor wordt er een milky substantie en er ontstaan 3 lagen
1. Waterfase, hierin bevindt het RNA
2. Interfase, hierin bevindt het DNA
3. Organische fase (oplosmiddelen), hierin bevinden zich onder andere de eiwitten

Isopropanol: zorgt ervoor dat het DNA en het RNA neerslaat

Nanodrop: apparaat die verschillende dingen in een kleine oplossing kan meten
• Zoals; RNA, DNA of vrije nucleotiden
- 230 nm: organische oplosmiddelen
- 260 nm: RNA en DNA
- 270 nm: piek van fenol
- 280 nm: eiwitten
- 320 nm: algemene achtergrond

, Biomethoden les 2
Het A260/280 ratio vertelt iets over de zuiverheid van het geïsoleerde RNA of DNA, hierbij moet de
waarde liggen tussen de 1,8 en de 2,0.

Deze ratio kan beïnvloedt worden door de pH, bij een hogere pH zal het eiwitgehalte lager zij. Dit kan
komen door het achterblijven van organische oplosmiddelen.

Je kan hiervoor ook kiezen voor een ribogreenassay of een picogreenassay, deze meten de vrije of
gebonden nucleotide. Maar deze techniek is arbeidsintensiever waardoor hij minder vaak wordt
gebruikt.

Voor het omzetten van RNA naar cDNA wordt reverse transcriptase gebruikt, hiervan zijn 3 soorten
1. Random hexameren, dit kan met RNA of DNA
o Voor DNA kan je het weghalen uit een cupje, dan moet er eerst DNase toegevoegd
worden.
2. Oligo dt primers
3. Gen specifieke primers, hierbij wordt de primer gemaakt voor het gen van interesse
o Dit is een 1 staps reactie
o Hierbij krijg je alleen het cDNA van dat stukje gen van interesse




In het experiment voor MRD wordt de M- MLV reverse transcriptase gebruikt, dit is een first strand
synthese systeem. Hierin zitten verschillende stoffen als:
- dNTP > voor het verlengen van DNA met nucleotiden, dus nodig voor de cDNA synthese
- DTT > zorgt voor een goede enzymwerking door het verbreken van de secundaire structuur
waardoor enkele strengen ontstaan
- RNase inhibitor > zorgt ervoor dat de afbraak van RNA stopt
- MgCl2 > zorgt voor het starten van de polymerase, dus voor enzymwerking

PCR mix kunnen berekenen:
Reagentia Stock Cc in 50 Verdunning Voor 1 reactie (50 Voor 31
microliter microliter) reacties
H2O
PCR rxn 10 x 1x 10 keer 50/10= 5 µl *31
dNTP’s 25 mM 250 µM 100 keer 50/100 = 0,5 µl *31
Primer F 25 µM 0,5 µM 50 keer 50/50 = 1 µl *31
Primer R 25 µM 0,5 µM 50 keer 50/50 = 1 µl *31
MgCl2 50 mM 1,5 mM 33,333 ,3 = 1,5 µl *31
keer
Taq. 5 U/ µl 0,04 U/ µl 125 keer 50/125 = 0,4 µl *31
Polymerase
Template 25 ng/ µl 1 ng/ µl 25 keer 2 µl *31

1,4% gel agarose, 75 ml
Massa = 75*0,014 = 1,05 gram agarose afwegen en aanvullen tot 75 ml
15,5 microliter van dNTP nodig, iets meer maken = 5 microliter van elk