Moleculaire diagnostiek - Introductie
Overzicht detectiemethoden en technieken:
- Biochemisch / immunologisch analyse van metabolieten en eiwitten (met enzymen en
antilichamen)
- Moleculair analyse van nucleïnezuren (met probes en sequentieanalyse)
Actueel voorbeeld:
Diagnostiek SARS-CoV-2 (verwekker van COVID-19)
Directie diagnostiek:
- RNA aantonen met RT-PCR (E-gen, RdRP-gen)
- Antigentest op viruseiwitten (sneltest, minder gevoelig)
Indirect (ooit in aanraking geweest met het virus)
- Serologische test
Moleculaire diagnostiek analyse van nucleïnezuren (DNA/RNA) kan ook afwijking aantonen
voordat de patiënt ziek is
Kerntechnieken moleculaire diagnostiek:
- Hybridisatie – specifieke sequentie aantonen bijzonder bio-specifiek (vergelijk
antilichamen)
- PCR – specifieke sequentie vermeerderen (in vitro) vergelijk: biologische vermeerdering
van organismen
- Sequentie analyse – specifieke sequentie volledig aflezen
Medische laboratoriumdiagnostiek
Methoden en technieken
Microscopische detectie kleuring weefselcomponenten
- Lichtmicroscopie
- Confocale microscopie
- Elektronenmicroscopie
Chemische detectie substraat – enzym (enzym assay)
- Fysisch chemisch (pH/kleuring)
- Organisch chemisch (GC-MS)
Immunologische detectie antigeen – antilichaam (immuno assay)
Moleculaire detectie nucleïnezuren hybridisatie (gene probe assay)
(In diagnostiek vaak combinaties van microscopische en moleculaire detectie)
Voorbeeld: diagnostiek van diabetes
1. Chemische detectie – glucose
2. Immunologische detectie – insuline
3. Moleculaire detectie – insuline receptor
Chemische detectie (enzymatische reactie)
Activiteit van enzym
- Substraat wordt omgezet door enzym in een product
- Bepaling van hoeveelheid substraat of enzymactiviteit
- Substraat of product wordt (meestal) spectrofotometrisch bepaald
(dus kan glucose meten of de activiteit van hexokinase)
Bepaling absorptie van het product NADPH: meten bij 340 nm (G6P kan niet worden gemeten)
Enzymatische reactie:
1 Bepaling van substraat. Voorbeeld: glucose
, - Alle glucose wordt door enzym hexokinase (HK) omgezet
- Vorming van een zichtbaar product (oranje) = glucose-6-fosfaat (G6P)
- Belangrijk: overmaat enzym toevoegen aan assay
2 Bepaling van enzymactiviteit. Voorbeeld: lactaatdehydrogenase (LDH)
- Meting van omzetting per minuut
- Afname van substraat pyruvaat (grijs) of vorming van product lactaat (oranje)
- Belangrijk: overmaat substraat toevoegen aan assay
Chemische detectie: bepaling van eiwitten
- Geïsoleerd enzym productie fluorescerend product
- Gekoppelde enzymreactie product wordt gebruikt door reporter enzym
- Membraanpreparaat stimulatie van receptor leidt tot binding van substraat
- Intacte cellen interactie van signaal pathways
Immunologische detectie (antigeen – antilichaam interactie (immunoassays))
Hoeveelheid eiwitmoleculen (immunoblot (Western blotting) / ELISA)
ELISA = enzyme linked immunosorbent assay
- Om de binding zichtbaar te maken krijgt een antilichaam een label (bv. een enzym)
- Polyclonale en monoclonale antilichamen
Principe:
1. Antigen bindt aan surface
2. Antilichaam-enzym bindt aan antigen
3. Substraat en enzym interactie veroorzaakt een kleurreactie (zichtbaar product wat kan
worden gemeten in bv een spectrofotometer)
Western blot
1. Gel elektroforese
2. Detectie met antilichamen
Voordelen immunologische detectie:
- Hoge specificiteit
- Hoge kwaliteit
Nadelen immunologische detectie:
- Moeilijk kwantitatief te krijgen
- Arbeidsintensief
- Gevoeligheid
Moleculaire detectie (nucleïnezuren hybridisatie (gene probe assays))
- Normale hybridisatie
- Hybridisatie met gelabelde probe
Probe bindt aan target reporter bindt aan label op de probe reactie
Hoe kom je aan antilichamen?
- Dieren konijn
- Insuline wordt ingespoten (je wilt een antilichaam tegen insuline hebben)
- H-ins = humaan insuline
- Bloed wordt afgenomen uit het oor
- Wanneer er genoeg antilichamen zijn wordt het konijn gedood en al het bloed met
antilichamen eruit gehaald
- Antiserum antilichamen tegen insuline en nog veel andere antilichaam polyclonaal
antiserum
Antilichamen
, - Y-vormig, 2 identieke bindingsplaatsen voor het antigen
- Het eiwit is opgebouwd uit 4 polypeptide ketens (2 zware en 2 lichte)
- Ketens door disulfidebruggen samengehouden
Productie van antilichamen
- Polyclonale antilichamen (antiserum) (mix van antilichamen)
- Monoclonale antilichamen (1975 Köhler & Milstein) (enkel antilichaam)
- Monovalente antilichamen (Fab fragmenten)
- Phage display (selectie/productie)
Productie van monoclonaal antilichaam
Hybridoma techniek
1. Immunisatie van muis
2. Isolatie van milt cellen
3. Fusie met myeloma cellen (tumor cellen) tot hybridoma
4. Clonale expansie (polyclonaal naar monoclonaal)
5. Productie van antilichaam door hybridoma in kweekcultuur
Hybridoma cellen 2 eigenschappen blijven doordelen / maken antilichamen
Het antilichaam kan worden gesplitst in functioneel verschillende fragmenten
- Een antilichaam dat wordt afgebroken door papaïne (enzym) veroorzaakt 3 fragmenten 2
Fab fragmenten en 1 Fc fragment (Fab = antigen-binding fragment) (Fc = fragment
crystallize)
- Een antilichaam dat wordt afgebroken door pepsine veroorzaakt 2 fragmenten een F(ab’)2
fragment en een pFc’ fragment
Recombinatie antilichaam fragmenten
Een scFv (single chain variable fragment) is een fusie-eiwit van VH en VL, verbonden met een korte
link peptide van ongeveer 20 aminozuren
Productie van specifiek antilichaam (monoclonaal)
Phage display library
1. Productie van een antilichaam (scFv) bibliotheek (DNA fragmenten)
2. Bibliotheek exprimeren op oppervlak van fagen (fage display library)
3. Fagen laten groeien
4. Selectie van fagen op met antigen gecoate platen (panning)
5. Amplificatie van fagen in E.coli
6. Productie van een compleet (Fab + Fc) antilichaam
Immunologische detectie methoden
- Agglutinatie (inhibitie)
- Radio immuno assay (RIA, gelabeld Ag)
- Immunoradiometric assay (IRMA, gelabeld Ab)
- Enzyme immuno assay (EIA, enzym labeling)
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
- Elispot
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Binding antilichaam aan target (antigen)
- Gebonden antilichaam wordt aangetoond met geconjugeerd (covalent gebonden) enzym
- Vorming van gekleurd (oplosbaar) product
- Kleur meten in spectrofotometer
Direct assay / indirect assay / avidin-biotin complex / capture assay ‘’sandwich’’
Overzicht detectiemethoden en technieken:
- Biochemisch / immunologisch analyse van metabolieten en eiwitten (met enzymen en
antilichamen)
- Moleculair analyse van nucleïnezuren (met probes en sequentieanalyse)
Actueel voorbeeld:
Diagnostiek SARS-CoV-2 (verwekker van COVID-19)
Directie diagnostiek:
- RNA aantonen met RT-PCR (E-gen, RdRP-gen)
- Antigentest op viruseiwitten (sneltest, minder gevoelig)
Indirect (ooit in aanraking geweest met het virus)
- Serologische test
Moleculaire diagnostiek analyse van nucleïnezuren (DNA/RNA) kan ook afwijking aantonen
voordat de patiënt ziek is
Kerntechnieken moleculaire diagnostiek:
- Hybridisatie – specifieke sequentie aantonen bijzonder bio-specifiek (vergelijk
antilichamen)
- PCR – specifieke sequentie vermeerderen (in vitro) vergelijk: biologische vermeerdering
van organismen
- Sequentie analyse – specifieke sequentie volledig aflezen
Medische laboratoriumdiagnostiek
Methoden en technieken
Microscopische detectie kleuring weefselcomponenten
- Lichtmicroscopie
- Confocale microscopie
- Elektronenmicroscopie
Chemische detectie substraat – enzym (enzym assay)
- Fysisch chemisch (pH/kleuring)
- Organisch chemisch (GC-MS)
Immunologische detectie antigeen – antilichaam (immuno assay)
Moleculaire detectie nucleïnezuren hybridisatie (gene probe assay)
(In diagnostiek vaak combinaties van microscopische en moleculaire detectie)
Voorbeeld: diagnostiek van diabetes
1. Chemische detectie – glucose
2. Immunologische detectie – insuline
3. Moleculaire detectie – insuline receptor
Chemische detectie (enzymatische reactie)
Activiteit van enzym
- Substraat wordt omgezet door enzym in een product
- Bepaling van hoeveelheid substraat of enzymactiviteit
- Substraat of product wordt (meestal) spectrofotometrisch bepaald
(dus kan glucose meten of de activiteit van hexokinase)
Bepaling absorptie van het product NADPH: meten bij 340 nm (G6P kan niet worden gemeten)
Enzymatische reactie:
1 Bepaling van substraat. Voorbeeld: glucose
, - Alle glucose wordt door enzym hexokinase (HK) omgezet
- Vorming van een zichtbaar product (oranje) = glucose-6-fosfaat (G6P)
- Belangrijk: overmaat enzym toevoegen aan assay
2 Bepaling van enzymactiviteit. Voorbeeld: lactaatdehydrogenase (LDH)
- Meting van omzetting per minuut
- Afname van substraat pyruvaat (grijs) of vorming van product lactaat (oranje)
- Belangrijk: overmaat substraat toevoegen aan assay
Chemische detectie: bepaling van eiwitten
- Geïsoleerd enzym productie fluorescerend product
- Gekoppelde enzymreactie product wordt gebruikt door reporter enzym
- Membraanpreparaat stimulatie van receptor leidt tot binding van substraat
- Intacte cellen interactie van signaal pathways
Immunologische detectie (antigeen – antilichaam interactie (immunoassays))
Hoeveelheid eiwitmoleculen (immunoblot (Western blotting) / ELISA)
ELISA = enzyme linked immunosorbent assay
- Om de binding zichtbaar te maken krijgt een antilichaam een label (bv. een enzym)
- Polyclonale en monoclonale antilichamen
Principe:
1. Antigen bindt aan surface
2. Antilichaam-enzym bindt aan antigen
3. Substraat en enzym interactie veroorzaakt een kleurreactie (zichtbaar product wat kan
worden gemeten in bv een spectrofotometer)
Western blot
1. Gel elektroforese
2. Detectie met antilichamen
Voordelen immunologische detectie:
- Hoge specificiteit
- Hoge kwaliteit
Nadelen immunologische detectie:
- Moeilijk kwantitatief te krijgen
- Arbeidsintensief
- Gevoeligheid
Moleculaire detectie (nucleïnezuren hybridisatie (gene probe assays))
- Normale hybridisatie
- Hybridisatie met gelabelde probe
Probe bindt aan target reporter bindt aan label op de probe reactie
Hoe kom je aan antilichamen?
- Dieren konijn
- Insuline wordt ingespoten (je wilt een antilichaam tegen insuline hebben)
- H-ins = humaan insuline
- Bloed wordt afgenomen uit het oor
- Wanneer er genoeg antilichamen zijn wordt het konijn gedood en al het bloed met
antilichamen eruit gehaald
- Antiserum antilichamen tegen insuline en nog veel andere antilichaam polyclonaal
antiserum
Antilichamen
, - Y-vormig, 2 identieke bindingsplaatsen voor het antigen
- Het eiwit is opgebouwd uit 4 polypeptide ketens (2 zware en 2 lichte)
- Ketens door disulfidebruggen samengehouden
Productie van antilichamen
- Polyclonale antilichamen (antiserum) (mix van antilichamen)
- Monoclonale antilichamen (1975 Köhler & Milstein) (enkel antilichaam)
- Monovalente antilichamen (Fab fragmenten)
- Phage display (selectie/productie)
Productie van monoclonaal antilichaam
Hybridoma techniek
1. Immunisatie van muis
2. Isolatie van milt cellen
3. Fusie met myeloma cellen (tumor cellen) tot hybridoma
4. Clonale expansie (polyclonaal naar monoclonaal)
5. Productie van antilichaam door hybridoma in kweekcultuur
Hybridoma cellen 2 eigenschappen blijven doordelen / maken antilichamen
Het antilichaam kan worden gesplitst in functioneel verschillende fragmenten
- Een antilichaam dat wordt afgebroken door papaïne (enzym) veroorzaakt 3 fragmenten 2
Fab fragmenten en 1 Fc fragment (Fab = antigen-binding fragment) (Fc = fragment
crystallize)
- Een antilichaam dat wordt afgebroken door pepsine veroorzaakt 2 fragmenten een F(ab’)2
fragment en een pFc’ fragment
Recombinatie antilichaam fragmenten
Een scFv (single chain variable fragment) is een fusie-eiwit van VH en VL, verbonden met een korte
link peptide van ongeveer 20 aminozuren
Productie van specifiek antilichaam (monoclonaal)
Phage display library
1. Productie van een antilichaam (scFv) bibliotheek (DNA fragmenten)
2. Bibliotheek exprimeren op oppervlak van fagen (fage display library)
3. Fagen laten groeien
4. Selectie van fagen op met antigen gecoate platen (panning)
5. Amplificatie van fagen in E.coli
6. Productie van een compleet (Fab + Fc) antilichaam
Immunologische detectie methoden
- Agglutinatie (inhibitie)
- Radio immuno assay (RIA, gelabeld Ag)
- Immunoradiometric assay (IRMA, gelabeld Ab)
- Enzyme immuno assay (EIA, enzym labeling)
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
- Elispot
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Binding antilichaam aan target (antigen)
- Gebonden antilichaam wordt aangetoond met geconjugeerd (covalent gebonden) enzym
- Vorming van gekleurd (oplosbaar) product
- Kleur meten in spectrofotometer
Direct assay / indirect assay / avidin-biotin complex / capture assay ‘’sandwich’’
