Moleculaire celbiologie - H.10 – 04/10/2017
Restrictie enzymen: bacteriële enzymen die DNA knippen. De sequentie die ze knippen zijn
vaak palindroom. Eigen DNA van de bacterie wordt niet geknipt door dit enzym.
Gelelektroforese: gel waarin je de stukjes DNA die je hebt
geknipt scheidt. De gel is een agarose gel. De stukjes DNA
worden gescheiden op grootte.
Om te bepalen hoe groot die DNA sequenties zijn, stop je ook
DNA markers in de gel. Van deze markers weet je de lengte. De
plaats waar deze markers dan komen in de gel kan je vergelijken
met de onbekende sequenties.
De banden die ontstaat in de gel kunnen zichtbaar worden
gemaakt met een fluorescente kleurstoffen of radio-isotopen.
Principe gelelektroforese
Je kan DNA denatureren (er enkelstrengs DNA van maken) door DNA te verhitten. Hierdoor
verbreken de waterstofbruggen tussen de DNA strengen. Het verbreken van deze
waterstofbruggen heet hybridisatie. Als je het DNA vervolgens weer langzaam afkoelt, dan
krijg je weer het originele dubbelstrengs DNA.
Nothern blotting: kijken naar RNA sequenties.
Southern blotting: kijken naar de DNA sequenties die je gescheiden hebt of er bijvoorbeeld
een bepaald gen aanwezig is in het DNA van een organisme. Stappen:
1. Denatureer DNA zodat je enkelstreng DNA krijgt
2. Voeg aan het DNA restrictie-enzymen toe zodat je kleine DNA fragmenten hebt
3. Doe een elektroforese
4. Plaats een filter op de gel. Hierdoor zullen de DNA fragmenten op het filter gaan zitten.
5. Stel dit filter dan bloot aan radio-gelabeld DNA. (als je wilt kijken of een bepaald gen
aanwezig is, neem dan de complementaire streng van het gen.
6. Leg het filter dan onder een X-ray. Als het radio-gelabeld DNA oplicht, dan weet je dus
dat het gebonden is aan een bepaalde sequentie en dan weet je dus dat dat gen aanwezig is
in een bepaald organisme.
DNA klonen in bacteriën: voor het klonen van DNA worden plasmiden in bacteriën
gebruikt. Verschillende stappen:
1. Er wordt een plasmide geïsoleerd uit een bacterie
2. Deze wordt vervolgens geknipt met een bepaald restrictie-enzym
3. Dan wordt het te klonen DNA fragment toegevoegd. Deze zal in de plasmide gaan zitten.
Je krijg dan een recombinante plasmide.
4. De plasmide wordt weer terug gestopt in de bacterie.
5. De bacterie wordt vervolgens vermenigvuldigd. Je krijg dan heel veel kopieën van die
recombinante plasmide en dus van je DNA.
6. Dat DNA kan je vervolgens weer uit de plasmiden halen en dan heb je je gekloonde DNA.
I.p.v. één bepaalde plasmide met één bepaald DNA fragment, kan je ook een collectie maken
van verschillende DNA fragmenten. Je krijgt dan een DNA liberary.
, Je kan DNA fragmenten die
gescheiden zijn door
hetzelfde of door andere
restrictie-enzymen weer
samenvoegen.
Restrictie: knippen
Ligatie: samenvoegen
Soms wil je alleen het DNA onderzoeken dat codeert
voor iets. Je kan dan gebruik maken van cDNA. cDNA
is gemaakt van mRNA. Uit mRNA zijn de introns
verwijdert. Als je hier dan DNA van maakt, dan heb je
alleen de delen van het DNA die coderen voor iets. Dit
proces heet reverse transcriptie. Je maakt i.p.v. mRNA
van DNA, DNA van mRNA.
Als je van deze cDNA’s een liberay zou maken, dan
representeert dat de mRNA’s die door een enkele cel
gemaakt worden. Dit kan je gebruiken voor onderzoek
naar genexpressie.
het maken van cDNA
PCR: polymerase chain reaction. Ook een manier om DNA te klonen. Stappen:
1. Er wordt een mengsel gemaakt van dubbelstrengs DNA, specifieke primers, nucleotiden
en tac polymerase
2. Dit mengsel wordt verhit tot 95 graden. Hierdoor gaan de dubbelstrengs DNA strengen uit
elkaar;
3. Dan wordt het mengsel afgekoeld tot 60 graden. Hierdoor binden de primers aan het
enkelstrengs DNA.
4. Daarna wordt het mengsel weer verhit tot 72 graden. Hierdoor gaat tac-polymerase
elongeren, hij gaat nucelotiden toevoegen.
5. Dit proces wordt elke keer herhaald. Op een gegeven moment heb je een heel veel
kopieën van een bepaald stuk van het DNA.
Waarvoor kan je PCR gebruiken:
Om veel kopieën van een bepaald stuk DNA te
maken
Om het genotype van iemand te bepalen
Om te kijken of iemand bepaalde virussen heeft.
Restrictie enzymen: bacteriële enzymen die DNA knippen. De sequentie die ze knippen zijn
vaak palindroom. Eigen DNA van de bacterie wordt niet geknipt door dit enzym.
Gelelektroforese: gel waarin je de stukjes DNA die je hebt
geknipt scheidt. De gel is een agarose gel. De stukjes DNA
worden gescheiden op grootte.
Om te bepalen hoe groot die DNA sequenties zijn, stop je ook
DNA markers in de gel. Van deze markers weet je de lengte. De
plaats waar deze markers dan komen in de gel kan je vergelijken
met de onbekende sequenties.
De banden die ontstaat in de gel kunnen zichtbaar worden
gemaakt met een fluorescente kleurstoffen of radio-isotopen.
Principe gelelektroforese
Je kan DNA denatureren (er enkelstrengs DNA van maken) door DNA te verhitten. Hierdoor
verbreken de waterstofbruggen tussen de DNA strengen. Het verbreken van deze
waterstofbruggen heet hybridisatie. Als je het DNA vervolgens weer langzaam afkoelt, dan
krijg je weer het originele dubbelstrengs DNA.
Nothern blotting: kijken naar RNA sequenties.
Southern blotting: kijken naar de DNA sequenties die je gescheiden hebt of er bijvoorbeeld
een bepaald gen aanwezig is in het DNA van een organisme. Stappen:
1. Denatureer DNA zodat je enkelstreng DNA krijgt
2. Voeg aan het DNA restrictie-enzymen toe zodat je kleine DNA fragmenten hebt
3. Doe een elektroforese
4. Plaats een filter op de gel. Hierdoor zullen de DNA fragmenten op het filter gaan zitten.
5. Stel dit filter dan bloot aan radio-gelabeld DNA. (als je wilt kijken of een bepaald gen
aanwezig is, neem dan de complementaire streng van het gen.
6. Leg het filter dan onder een X-ray. Als het radio-gelabeld DNA oplicht, dan weet je dus
dat het gebonden is aan een bepaalde sequentie en dan weet je dus dat dat gen aanwezig is
in een bepaald organisme.
DNA klonen in bacteriën: voor het klonen van DNA worden plasmiden in bacteriën
gebruikt. Verschillende stappen:
1. Er wordt een plasmide geïsoleerd uit een bacterie
2. Deze wordt vervolgens geknipt met een bepaald restrictie-enzym
3. Dan wordt het te klonen DNA fragment toegevoegd. Deze zal in de plasmide gaan zitten.
Je krijg dan een recombinante plasmide.
4. De plasmide wordt weer terug gestopt in de bacterie.
5. De bacterie wordt vervolgens vermenigvuldigd. Je krijg dan heel veel kopieën van die
recombinante plasmide en dus van je DNA.
6. Dat DNA kan je vervolgens weer uit de plasmiden halen en dan heb je je gekloonde DNA.
I.p.v. één bepaalde plasmide met één bepaald DNA fragment, kan je ook een collectie maken
van verschillende DNA fragmenten. Je krijgt dan een DNA liberary.
, Je kan DNA fragmenten die
gescheiden zijn door
hetzelfde of door andere
restrictie-enzymen weer
samenvoegen.
Restrictie: knippen
Ligatie: samenvoegen
Soms wil je alleen het DNA onderzoeken dat codeert
voor iets. Je kan dan gebruik maken van cDNA. cDNA
is gemaakt van mRNA. Uit mRNA zijn de introns
verwijdert. Als je hier dan DNA van maakt, dan heb je
alleen de delen van het DNA die coderen voor iets. Dit
proces heet reverse transcriptie. Je maakt i.p.v. mRNA
van DNA, DNA van mRNA.
Als je van deze cDNA’s een liberay zou maken, dan
representeert dat de mRNA’s die door een enkele cel
gemaakt worden. Dit kan je gebruiken voor onderzoek
naar genexpressie.
het maken van cDNA
PCR: polymerase chain reaction. Ook een manier om DNA te klonen. Stappen:
1. Er wordt een mengsel gemaakt van dubbelstrengs DNA, specifieke primers, nucleotiden
en tac polymerase
2. Dit mengsel wordt verhit tot 95 graden. Hierdoor gaan de dubbelstrengs DNA strengen uit
elkaar;
3. Dan wordt het mengsel afgekoeld tot 60 graden. Hierdoor binden de primers aan het
enkelstrengs DNA.
4. Daarna wordt het mengsel weer verhit tot 72 graden. Hierdoor gaat tac-polymerase
elongeren, hij gaat nucelotiden toevoegen.
5. Dit proces wordt elke keer herhaald. Op een gegeven moment heb je een heel veel
kopieën van een bepaald stuk van het DNA.
Waarvoor kan je PCR gebruiken:
Om veel kopieën van een bepaald stuk DNA te
maken
Om het genotype van iemand te bepalen
Om te kijken of iemand bepaalde virussen heeft.
