Inhoud
Les 1 Basisbegrippen voor scheidingsmethoden en gelfiltratie .............................................................. 2
Les 4 ionenwisselingschromatografie ..................................................................................................... 9
Kennis over pH, zuren, basen en buffers uit de VL2 cursus Cellulaire biochemie. ............................. 2
PS H50 Chromatography – separation methods ................................................................................. 2
Leerstof ‘Gelfiltratie’ ........................................................................................................................... 6
Leerstof Affiniteitschromatografie ...................................................................................................... 7
Leerstof ‘Ionenwisselingschromatografie’ .......................................................................................... 9
PS H51 Chromatography – detection and analysis ........................................................................... 11
Les 2 Affiniteitschromatografie en scheiding op basis van polariteit ................................................... 13
Campbell H5.4 Eiwitten ..................................................................................................................... 13
Les 3 Elektroforese ................................................................................................................................ 16
PS H52 Principles and practise of electrophoresis ............................................................................ 16
PS H53 Advanced electrophoretic techniques .................................................................................. 17
Les 5 Lichtmicroscopie en Les 6 Overige microscopische technieken .................................................. 22
PS H28 Introduction to microscopy ................................................................................................... 22
PS H29 Setting up and using a light microscope ............................................................................... 26
Leerstof.............................................................................................................................................. 27
Les 7 Fluorescentie ................................................................................................................................ 32
PS H46 Measuring light ..................................................................................................................... 32
PS H47 Basic spectroscopy ................................................................................................................ 32
Leerstof.............................................................................................................................................. 32
Les 8 Centrifugeren ............................................................................................................................... 37
PS H49 Centrifugation ....................................................................................................................... 37
Leerstof.............................................................................................................................................. 38
Les 9 Massa spectrometrie.................................................................................................................... 42
PS H48 Advanced spectroscopy and spectrometry (p323) ............................................................... 42
PS H51 Chromatography detection and analysis (p345) ................................................................... 46
Theorie Massa-spectrometrie ........................................................................................................... 46
Les 10 Chemisch Rekenen ..................................................................................................................... 47
PS H25 Basic laboratory procedures (t/m p156) ............................................................................... 49
PS H26 Principles of solution chemistry (t/m p164).......................................................................... 49
Les 11 Flow (vloeibare) cyto (cel) metrie (meting)................................................................................ 50
Leerstof.............................................................................................................................................. 50
,Les 1 Basisbegrippen voor scheidingsmethoden en gelfiltratie
Kennis over pH, zuren, basen en buffers uit de VL2 cursus Cellulaire biochemie.
PS H50 Chromatography – separation methods
Je wilt dingen scheiden, omdat je 1 specifiek deeltje wilt hebben uit een mengsel.
Insuline kan bij diabetes patiënten worden toegediend uit bacteriën. Je wilt insuline zo zuiver
mogelijk, omdat je geen andere bacteriën wilt inbrengen.
Methode om te zuiveren:
Chromatografie= deeltjes worden gescheiden op basis van grootte, vorm, lading, bewegelijkheid,
oplosbaarheid en adsorptie vermogen.
• Stationaire fase= (vast of vloeibaar) absorberend materiaal op het chromatografisch bed.
• Mobiele fase= (vloeibaar of gas) wordt via delivery system opgebracht en verplaatst het
monster door de stationaire fase.
o Chromatografisch bed= de stationaire fase kan verpakt worden in een glazen of
metalen kolom, als een dun laagje verspreid over glas, plastic of papier.
o Delivery systeem= om de mobiele fase op het chromatografisch bed te brengen.
o Detectie systeem= om de te testen substanties te monitoren.
Stoffen met een grote aantrekkingskracht voor de stationaire fase, komen vertraagd van de kolom.
Stoffen die slecht binden komen verder in de kolom.
Diffusie is een probleem:
• Als eiwitten langzaam over de kolom lopen hebben ze tijd om te verspreiden. Hierdoor
worden kolommen breder. Wanneer ze overlappen kan dit de scheiding beïnvloeden.
• Het duurt lang voordat alle eiwitten van de kolom zijn.
• Stoffen kunnen met elkaar vermengd blijven.
• Concentratie eiwit in de elutievloeistof daalt.
• Preparatief= je zuivert iets waar je verder mee wilt (insuline).
• Analytisch= je wilt de samenstelling van de stof weten.
Typen van een chromatografie systeem:
• Dunne laag chromatografie: een glazen plaat (TLC) met een vaste fase erop. De samples
worden als stippen aangebracht door microsyringe/microcapillary. De loopvloeistof trekt in
de plaat omhoog en neemt de samples mee door de capillaire werking. De plaat mag
verwijderd worden als de stoffen 80 tot 90% van de lengte zijn verplaatst
Er zit een deksel op, omdat het vaak een vluchtige vloeistof is.
De stof wordt zichtbaar gemaakt door: UV, aankleuren, radioactiviteit.
Je kunt de stof vergelijken met de afgelegde afstand door referentie of door de loopvloeistof.
, RF en Rx kunnen in tabellen worden opgezocht.
• Kolom chromatografie: De stoffen scheiden in de kolom en hebben verschillende tijden
waarin ze door de kolom passeren. Glass wool is om de voorkomen dat het kolom materiaal
eruit loopt. De meeste detectoren zijn niet-detructief (=verzamelen materiaal voor verdere
studie). De verschillende fracties kunnen geanalyseerd worden. Ze kunnen uitgezet worden
in een chromatogram. De tijd op de horizontale as en de hoeveelheid stof op de verticale as.
Hoe sneller het materiaal er door heen gaat, hoe minder last van diffusie. Hiervoor wordt
gebruikt:
o High performance liquid chromatography (HPLC)
▪ Hoge druk, componenten systeem bestand tegen druk
▪ Vooral kleine biologische moleculen
Vaak gemaakt van stainless steel en materialen die hoge druk kunnen weerstaan.
Het filter is om te ontgassen.
o Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)
▪ Lagere druk, componenten die geen eiwit-denaturatie veroorzaken
▪ Grotere moleculen zoals eiwitten
Er moet opgelet worden dat de snelheid laag genoeg is voor goede scheiding, maar
hoog genoeg om diffusie te voorkomen.
• Gas chromatografie: de mobiele fase is een gas en de stationaire fase is een vloeistof (vaak
een cross-linked silicone polymeer).
Scheiding wordt bereikt als gevolg verschillende verdeling van de stoffen tussen de fasen van
dragergas en siliconenpolymeer.
Het chromatogram:
, UV licht wordt langs de uitgang van de kolom, wanneer er een stofje langs komt ontstaat er een piek.
Hoe meer stof, hoe hoger de piek.
Breedte en de hoogte van een piek geeft het oppervlakte onder de grafiek. Dit is een maat van
hoeveel je hebt van een bepaalde stof.
Hoe smaller de pieken zijn, hoe beter de resolutie. Een brede piek kan het gevolg zijn van diffusie.
Een goede resolutie= 2 gescheiden pieken.
Schotelgetal= een maat voor het aantal pieken die je goed gescheiden in een kolom kunt krijgen. Hoe
hoger, hoe beter de scheiding. Efficiëntie (=hoe smal ze zijn) kan verhoogd worden door:
• Lengte van de kolom verhogen. (Kolommen in serie plaatsen).
• Kwaliteit van kolom materiaal (€ € € € €), kleinere deeltjes.
• Constante doorloopsnelheid.
• De helling in het zoutgradiënt.
Les 1 Basisbegrippen voor scheidingsmethoden en gelfiltratie .............................................................. 2
Les 4 ionenwisselingschromatografie ..................................................................................................... 9
Kennis over pH, zuren, basen en buffers uit de VL2 cursus Cellulaire biochemie. ............................. 2
PS H50 Chromatography – separation methods ................................................................................. 2
Leerstof ‘Gelfiltratie’ ........................................................................................................................... 6
Leerstof Affiniteitschromatografie ...................................................................................................... 7
Leerstof ‘Ionenwisselingschromatografie’ .......................................................................................... 9
PS H51 Chromatography – detection and analysis ........................................................................... 11
Les 2 Affiniteitschromatografie en scheiding op basis van polariteit ................................................... 13
Campbell H5.4 Eiwitten ..................................................................................................................... 13
Les 3 Elektroforese ................................................................................................................................ 16
PS H52 Principles and practise of electrophoresis ............................................................................ 16
PS H53 Advanced electrophoretic techniques .................................................................................. 17
Les 5 Lichtmicroscopie en Les 6 Overige microscopische technieken .................................................. 22
PS H28 Introduction to microscopy ................................................................................................... 22
PS H29 Setting up and using a light microscope ............................................................................... 26
Leerstof.............................................................................................................................................. 27
Les 7 Fluorescentie ................................................................................................................................ 32
PS H46 Measuring light ..................................................................................................................... 32
PS H47 Basic spectroscopy ................................................................................................................ 32
Leerstof.............................................................................................................................................. 32
Les 8 Centrifugeren ............................................................................................................................... 37
PS H49 Centrifugation ....................................................................................................................... 37
Leerstof.............................................................................................................................................. 38
Les 9 Massa spectrometrie.................................................................................................................... 42
PS H48 Advanced spectroscopy and spectrometry (p323) ............................................................... 42
PS H51 Chromatography detection and analysis (p345) ................................................................... 46
Theorie Massa-spectrometrie ........................................................................................................... 46
Les 10 Chemisch Rekenen ..................................................................................................................... 47
PS H25 Basic laboratory procedures (t/m p156) ............................................................................... 49
PS H26 Principles of solution chemistry (t/m p164).......................................................................... 49
Les 11 Flow (vloeibare) cyto (cel) metrie (meting)................................................................................ 50
Leerstof.............................................................................................................................................. 50
,Les 1 Basisbegrippen voor scheidingsmethoden en gelfiltratie
Kennis over pH, zuren, basen en buffers uit de VL2 cursus Cellulaire biochemie.
PS H50 Chromatography – separation methods
Je wilt dingen scheiden, omdat je 1 specifiek deeltje wilt hebben uit een mengsel.
Insuline kan bij diabetes patiënten worden toegediend uit bacteriën. Je wilt insuline zo zuiver
mogelijk, omdat je geen andere bacteriën wilt inbrengen.
Methode om te zuiveren:
Chromatografie= deeltjes worden gescheiden op basis van grootte, vorm, lading, bewegelijkheid,
oplosbaarheid en adsorptie vermogen.
• Stationaire fase= (vast of vloeibaar) absorberend materiaal op het chromatografisch bed.
• Mobiele fase= (vloeibaar of gas) wordt via delivery system opgebracht en verplaatst het
monster door de stationaire fase.
o Chromatografisch bed= de stationaire fase kan verpakt worden in een glazen of
metalen kolom, als een dun laagje verspreid over glas, plastic of papier.
o Delivery systeem= om de mobiele fase op het chromatografisch bed te brengen.
o Detectie systeem= om de te testen substanties te monitoren.
Stoffen met een grote aantrekkingskracht voor de stationaire fase, komen vertraagd van de kolom.
Stoffen die slecht binden komen verder in de kolom.
Diffusie is een probleem:
• Als eiwitten langzaam over de kolom lopen hebben ze tijd om te verspreiden. Hierdoor
worden kolommen breder. Wanneer ze overlappen kan dit de scheiding beïnvloeden.
• Het duurt lang voordat alle eiwitten van de kolom zijn.
• Stoffen kunnen met elkaar vermengd blijven.
• Concentratie eiwit in de elutievloeistof daalt.
• Preparatief= je zuivert iets waar je verder mee wilt (insuline).
• Analytisch= je wilt de samenstelling van de stof weten.
Typen van een chromatografie systeem:
• Dunne laag chromatografie: een glazen plaat (TLC) met een vaste fase erop. De samples
worden als stippen aangebracht door microsyringe/microcapillary. De loopvloeistof trekt in
de plaat omhoog en neemt de samples mee door de capillaire werking. De plaat mag
verwijderd worden als de stoffen 80 tot 90% van de lengte zijn verplaatst
Er zit een deksel op, omdat het vaak een vluchtige vloeistof is.
De stof wordt zichtbaar gemaakt door: UV, aankleuren, radioactiviteit.
Je kunt de stof vergelijken met de afgelegde afstand door referentie of door de loopvloeistof.
, RF en Rx kunnen in tabellen worden opgezocht.
• Kolom chromatografie: De stoffen scheiden in de kolom en hebben verschillende tijden
waarin ze door de kolom passeren. Glass wool is om de voorkomen dat het kolom materiaal
eruit loopt. De meeste detectoren zijn niet-detructief (=verzamelen materiaal voor verdere
studie). De verschillende fracties kunnen geanalyseerd worden. Ze kunnen uitgezet worden
in een chromatogram. De tijd op de horizontale as en de hoeveelheid stof op de verticale as.
Hoe sneller het materiaal er door heen gaat, hoe minder last van diffusie. Hiervoor wordt
gebruikt:
o High performance liquid chromatography (HPLC)
▪ Hoge druk, componenten systeem bestand tegen druk
▪ Vooral kleine biologische moleculen
Vaak gemaakt van stainless steel en materialen die hoge druk kunnen weerstaan.
Het filter is om te ontgassen.
o Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)
▪ Lagere druk, componenten die geen eiwit-denaturatie veroorzaken
▪ Grotere moleculen zoals eiwitten
Er moet opgelet worden dat de snelheid laag genoeg is voor goede scheiding, maar
hoog genoeg om diffusie te voorkomen.
• Gas chromatografie: de mobiele fase is een gas en de stationaire fase is een vloeistof (vaak
een cross-linked silicone polymeer).
Scheiding wordt bereikt als gevolg verschillende verdeling van de stoffen tussen de fasen van
dragergas en siliconenpolymeer.
Het chromatogram:
, UV licht wordt langs de uitgang van de kolom, wanneer er een stofje langs komt ontstaat er een piek.
Hoe meer stof, hoe hoger de piek.
Breedte en de hoogte van een piek geeft het oppervlakte onder de grafiek. Dit is een maat van
hoeveel je hebt van een bepaalde stof.
Hoe smaller de pieken zijn, hoe beter de resolutie. Een brede piek kan het gevolg zijn van diffusie.
Een goede resolutie= 2 gescheiden pieken.
Schotelgetal= een maat voor het aantal pieken die je goed gescheiden in een kolom kunt krijgen. Hoe
hoger, hoe beter de scheiding. Efficiëntie (=hoe smal ze zijn) kan verhoogd worden door:
• Lengte van de kolom verhogen. (Kolommen in serie plaatsen).
• Kwaliteit van kolom materiaal (€ € € € €), kleinere deeltjes.
• Constante doorloopsnelheid.
• De helling in het zoutgradiënt.
