METHODEN:
THEMA 2: DNA
DNA SEQUENCTIEBEPALING :
De novo sequencing = ongekend genoom v bv nieuwe organismen/soorten, gedeeltelijk of volledig
Resequencing = seq v individu tov referentiegenoom, verschillen tss individuen (mutaties, klinisch)
Sequentiebepaling als teller = aant DNA molec
• Whole genome seq = WGS = het gehele genoom
• Whole exome seq = WES = enkel de coderende stukken/ exonen
• Targeted seq = specif gewenste regio
• Transcriptoom = RNA -> cDNA
1ST GENERATION SEQUENING :
Maxam en Gilbert = chemische klievingsmethode
• Differentiele chem klieving v NZ in 4 # reacties + scheiding volgens lengte (elektroforese)
• 4 tubes : C + C/T + G + G/A
• Nadeel = relatief korte fragm + niet volledig 1duidig/specifiek
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
• Template/matrijs = clone of PCR amplicon
• Polymerase + primer + mengsel 4 dNTP (≠2’OH) + ddNTPs (≠2’OH + 3’OH)
o Polymerase = thermostabiel + knn ddNTP en dNTP inbouwen zonder onderscheid
o Primer = tegen plasmide want fragm hierin of tegen pcrprimer
• Ketenterminatie na inbouw v fluor gemerkte ddNTP
• Gelelektroforese
o Phred score Q = -10log(P) = 1/Q is de kans op een fout
o Liefst Q = 30 = accuraatheid van 99,9% = 1/30 fout
• Nadeel = beperkt tot 500nt + moeite met herhalingen
o Veel G of C : 3Hbruggen = moeilijk los te komen en vormt lussen
▪ Fragment wordt kleiner dan oorspronkelijk is, sneller door scheiding
o Grotere betrouwbaarheid = reactie zowel met reverse als forward primer
Enorme impact:
• Techn ontwikkeling v sequencen: automatisering (↓kost + ↑seqdata) + aanpak
• Grote ontwikkeling v bioinformatica
• Visie op delen v data (open science, data)
• Andere methoden want nu bijna volledige seq beschikbaar
• Biol kennist: vergelijkende genomics (inzicht in evolutie, genetische verschillen,..)
1
,Nieuwe uitdagingen:
• Volledige seq (telomeer-telomeer)
• Meer genoom sequenecn v meerdere species
• Meer indiv humane seq
• Persoonlijke genoomseq v iedereen → personalized precision medicine
o Kennis v DNA volgorde en SNPs: diagnose, prognose, preventie
o Farmacogenetics: voorspellen hoe mensen op medicijnen reageren
o Inzicht op complexe multifactoriele aandoeningen (kanker)
o Therapie op maat
Probleem sanger sequencing = throughput + kosten
2D GENERATION SEQUENCING:
= next generation sequencing / short read NGS = massief parallel sequencen v clonaal in vitro
Doel = veel hogere throughput aan veel lagere kost → massale DNA seqbepaling
Richtdoel = 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor 1000 dollar per genoom
Ontwikkeling met 3pijlers:
• Parallele detectie : cluster = kopien v DNA template + clonale in vitro amplificatie v template
o Duizenden-miljoenen kopien v DNA template per cluster
o Multiplexing: vele clusters tegelijk
• Miniaturisatie v reacties (picoliters)
• Integratie vh proces: alles in 1 stap, directe detectie
Stap 1: aanmaak DNA library
= fragmentenbank = verzameling vd te sequencen templates
• Whole genome sequencing
• Whole exome sequencing / targeted sequencing : aanrijking door hybridisatie aan probes
o Hybridiseren op beads of array met oligont complementair aan exonseq
o Ofwel PCR: genomisch DNA met pool v PCR primers tegen alle exonseq en dus enkel
deze amplificeren en vervolgens sequencen
• Mate pair libraries
• Amplicon sequencing; PCR amplicons
• cDNA library (RNA sequencing)
o tellen v hvl bepaalde sequentie tot expressie komt
1. input DNA kwaliteitscontrole : hvlh + concentratie + zuiverheid (260/230 en 260/280) + integriteit
2. random fragmentatie: sonicatie, nebulisatie (verneveling), DNAse I
2
,3. end repair = blunt ends maken
• T4 DNA polymerase + klenow fragment: 5‘-3‘: polymerase / 3‘-5‘: exonuclease = proofreading
• T4 polynucleotide kinase: 5’ uiteinde fosforyleren
• Taq polymerase : 3’ non-template A aanhechten
4. adaptoren aanhechten:
• Nodig voor PCR primers + sequencing primers + eventueel barcodes
• Ligatie met fragm uiteinden (sticky end met 3’ A overhang of blunt-end)
• Selectie fragm met 2# adaptoren
• Enkele pcr cycli: fragm met adapters amplificeren
Selecteren fragmenten met 2# adaptoren:
• 2 soorten adaptoren : 1tje = gebiotinyleerd + 1tje niet
o Enkel dus fragm nodig met 2# adaptoren = aan 1 kant gebiotinyleerd
• Bead met streptavidine binden de adaptoren met biotine
o Juiste fragm binden met 1 kant aan bead
o Fragm met 2 adapt met biotine binden met 2 kanten + vormen lus
o Fragm met 2 adapt zonder biotine binden gwn niet
• Denaturatie : hierdoor lost fragm aan 1 kant v bead waardoor de juiste fragm nu ook lossen
Alternatief = tagmentatie : fragmentatie + adaptors aanhechten in 1 stap
→ transposase enzym met dubbele activiteit: knipt + voegt adaptors toe
→PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adaptors
5. size selection : gewenste lengte selecteren = niet te lang (niet seq) + niet te kort (adaptordimeren)
• Agarose gel elektroforese : gewenste lengtes uitsnijden + opzuiveren alcoholprecip
• Magentic beads dat DNA bindt : verhouding bepaalt lengte
o Kleine hvlh beads: bindt enkel lange fragm → beads capteren en wegdoen
o Grotere hvlh beads: bindt de middellange fragm → beads capteren + vlst weg
o Spelen met verhoudingen voor gewenste lengte + gebruikt platform
6. kwaliteitscontrole :
• Gewenste lengte + concentr inserts controleren + gewenste verhouding voor poolen libraries
• Capillaire elektroforese
3
, Stap 2: klonale in vitro amplificatie
= simultane, gescheiden amplificatie v miljoenen fragm niet in bacterie maar vaak met PCR
Emulsie PCR:
• Beads met PCR primers zullen de fragm vd fragmbank binden
o 1 fragm bindt met 1bead en amplificatie gebeurt op bead via PCR
• Beads = hydrofiel : waterlaag met alle reagentie voor reactie
• Beads gescheiden door olie = olie-emulsie:
o kleine waterdruppels in olie met elke druppel een reactievat
o 1000den aparte reacties in 1 buisje
o 1000den kopien v zelfde DNA molec gebonden op 1 bepaalde bead
• Beads met DNA fragmenten isoleren vd beads zonder DNA fragm
o 2de soort grotere beads met primer die alle beads capteren met fragm
o Densiteitscentrifugatie om deze te scheiden v elkaar
Solid phase bridge amplification:
• Vast oppervlak met oligont/PCR primers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Door brownse beweging vormen de fragm lokaal bruggetjes
o Buigen af op korte afstand en binden met adaptor aan andere primer in buurt
o Zo aanmaak v complementaire streng en kan dit zich telkens herhalen
o Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec op 1-2 µm spot
Solid phase template walking (wildfire):
• Vast oppervlak met oligont/PCRprimers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Primer walking :
o PCRprimer seq zo gekozen dat die makkelijk lost : partiele denaturatie v dsDNA
o Het uiteinde zal dan naar naburige primer gaan op plaat en binden
o Opnieuw amplificatie via PCR
• Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec
Rolling circle amplification (in oplossing):
• Specifieke adaptoren aanhangen die zorgen dat alles circuleert + bindingsplaats voor RE type 3
o Vormen v circulair DNA via ligatie
• RE 3 = endonuclease : knipt cirkel + ligeren v 2de set adaptoren
o dit wordt aantal keer herhaalt zodat we circulair dsDNA hebben met # sets v adaptoren
o 1 cirkel = # adaptoren met hiertss telkens een kort stuk oorspronk fragm om te seq
• Rolling circle amplificatie:
o Oorspronkelijke adaptor = bindingsplaats voor polymerase : start amplificatie
o Cirkel : geen stop v amplificatie + meerdere kopies
• Clusters = nanoballs = lange DNA molec met meerdere kopies v template na elkaar
o Deze hybridiseren op vaste drager
4
THEMA 2: DNA
DNA SEQUENCTIEBEPALING :
De novo sequencing = ongekend genoom v bv nieuwe organismen/soorten, gedeeltelijk of volledig
Resequencing = seq v individu tov referentiegenoom, verschillen tss individuen (mutaties, klinisch)
Sequentiebepaling als teller = aant DNA molec
• Whole genome seq = WGS = het gehele genoom
• Whole exome seq = WES = enkel de coderende stukken/ exonen
• Targeted seq = specif gewenste regio
• Transcriptoom = RNA -> cDNA
1ST GENERATION SEQUENING :
Maxam en Gilbert = chemische klievingsmethode
• Differentiele chem klieving v NZ in 4 # reacties + scheiding volgens lengte (elektroforese)
• 4 tubes : C + C/T + G + G/A
• Nadeel = relatief korte fragm + niet volledig 1duidig/specifiek
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
• Template/matrijs = clone of PCR amplicon
• Polymerase + primer + mengsel 4 dNTP (≠2’OH) + ddNTPs (≠2’OH + 3’OH)
o Polymerase = thermostabiel + knn ddNTP en dNTP inbouwen zonder onderscheid
o Primer = tegen plasmide want fragm hierin of tegen pcrprimer
• Ketenterminatie na inbouw v fluor gemerkte ddNTP
• Gelelektroforese
o Phred score Q = -10log(P) = 1/Q is de kans op een fout
o Liefst Q = 30 = accuraatheid van 99,9% = 1/30 fout
• Nadeel = beperkt tot 500nt + moeite met herhalingen
o Veel G of C : 3Hbruggen = moeilijk los te komen en vormt lussen
▪ Fragment wordt kleiner dan oorspronkelijk is, sneller door scheiding
o Grotere betrouwbaarheid = reactie zowel met reverse als forward primer
Enorme impact:
• Techn ontwikkeling v sequencen: automatisering (↓kost + ↑seqdata) + aanpak
• Grote ontwikkeling v bioinformatica
• Visie op delen v data (open science, data)
• Andere methoden want nu bijna volledige seq beschikbaar
• Biol kennist: vergelijkende genomics (inzicht in evolutie, genetische verschillen,..)
1
,Nieuwe uitdagingen:
• Volledige seq (telomeer-telomeer)
• Meer genoom sequenecn v meerdere species
• Meer indiv humane seq
• Persoonlijke genoomseq v iedereen → personalized precision medicine
o Kennis v DNA volgorde en SNPs: diagnose, prognose, preventie
o Farmacogenetics: voorspellen hoe mensen op medicijnen reageren
o Inzicht op complexe multifactoriele aandoeningen (kanker)
o Therapie op maat
Probleem sanger sequencing = throughput + kosten
2D GENERATION SEQUENCING:
= next generation sequencing / short read NGS = massief parallel sequencen v clonaal in vitro
Doel = veel hogere throughput aan veel lagere kost → massale DNA seqbepaling
Richtdoel = 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor 1000 dollar per genoom
Ontwikkeling met 3pijlers:
• Parallele detectie : cluster = kopien v DNA template + clonale in vitro amplificatie v template
o Duizenden-miljoenen kopien v DNA template per cluster
o Multiplexing: vele clusters tegelijk
• Miniaturisatie v reacties (picoliters)
• Integratie vh proces: alles in 1 stap, directe detectie
Stap 1: aanmaak DNA library
= fragmentenbank = verzameling vd te sequencen templates
• Whole genome sequencing
• Whole exome sequencing / targeted sequencing : aanrijking door hybridisatie aan probes
o Hybridiseren op beads of array met oligont complementair aan exonseq
o Ofwel PCR: genomisch DNA met pool v PCR primers tegen alle exonseq en dus enkel
deze amplificeren en vervolgens sequencen
• Mate pair libraries
• Amplicon sequencing; PCR amplicons
• cDNA library (RNA sequencing)
o tellen v hvl bepaalde sequentie tot expressie komt
1. input DNA kwaliteitscontrole : hvlh + concentratie + zuiverheid (260/230 en 260/280) + integriteit
2. random fragmentatie: sonicatie, nebulisatie (verneveling), DNAse I
2
,3. end repair = blunt ends maken
• T4 DNA polymerase + klenow fragment: 5‘-3‘: polymerase / 3‘-5‘: exonuclease = proofreading
• T4 polynucleotide kinase: 5’ uiteinde fosforyleren
• Taq polymerase : 3’ non-template A aanhechten
4. adaptoren aanhechten:
• Nodig voor PCR primers + sequencing primers + eventueel barcodes
• Ligatie met fragm uiteinden (sticky end met 3’ A overhang of blunt-end)
• Selectie fragm met 2# adaptoren
• Enkele pcr cycli: fragm met adapters amplificeren
Selecteren fragmenten met 2# adaptoren:
• 2 soorten adaptoren : 1tje = gebiotinyleerd + 1tje niet
o Enkel dus fragm nodig met 2# adaptoren = aan 1 kant gebiotinyleerd
• Bead met streptavidine binden de adaptoren met biotine
o Juiste fragm binden met 1 kant aan bead
o Fragm met 2 adapt met biotine binden met 2 kanten + vormen lus
o Fragm met 2 adapt zonder biotine binden gwn niet
• Denaturatie : hierdoor lost fragm aan 1 kant v bead waardoor de juiste fragm nu ook lossen
Alternatief = tagmentatie : fragmentatie + adaptors aanhechten in 1 stap
→ transposase enzym met dubbele activiteit: knipt + voegt adaptors toe
→PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adaptors
5. size selection : gewenste lengte selecteren = niet te lang (niet seq) + niet te kort (adaptordimeren)
• Agarose gel elektroforese : gewenste lengtes uitsnijden + opzuiveren alcoholprecip
• Magentic beads dat DNA bindt : verhouding bepaalt lengte
o Kleine hvlh beads: bindt enkel lange fragm → beads capteren en wegdoen
o Grotere hvlh beads: bindt de middellange fragm → beads capteren + vlst weg
o Spelen met verhoudingen voor gewenste lengte + gebruikt platform
6. kwaliteitscontrole :
• Gewenste lengte + concentr inserts controleren + gewenste verhouding voor poolen libraries
• Capillaire elektroforese
3
, Stap 2: klonale in vitro amplificatie
= simultane, gescheiden amplificatie v miljoenen fragm niet in bacterie maar vaak met PCR
Emulsie PCR:
• Beads met PCR primers zullen de fragm vd fragmbank binden
o 1 fragm bindt met 1bead en amplificatie gebeurt op bead via PCR
• Beads = hydrofiel : waterlaag met alle reagentie voor reactie
• Beads gescheiden door olie = olie-emulsie:
o kleine waterdruppels in olie met elke druppel een reactievat
o 1000den aparte reacties in 1 buisje
o 1000den kopien v zelfde DNA molec gebonden op 1 bepaalde bead
• Beads met DNA fragmenten isoleren vd beads zonder DNA fragm
o 2de soort grotere beads met primer die alle beads capteren met fragm
o Densiteitscentrifugatie om deze te scheiden v elkaar
Solid phase bridge amplification:
• Vast oppervlak met oligont/PCR primers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Door brownse beweging vormen de fragm lokaal bruggetjes
o Buigen af op korte afstand en binden met adaptor aan andere primer in buurt
o Zo aanmaak v complementaire streng en kan dit zich telkens herhalen
o Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec op 1-2 µm spot
Solid phase template walking (wildfire):
• Vast oppervlak met oligont/PCRprimers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Primer walking :
o PCRprimer seq zo gekozen dat die makkelijk lost : partiele denaturatie v dsDNA
o Het uiteinde zal dan naar naburige primer gaan op plaat en binden
o Opnieuw amplificatie via PCR
• Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec
Rolling circle amplification (in oplossing):
• Specifieke adaptoren aanhangen die zorgen dat alles circuleert + bindingsplaats voor RE type 3
o Vormen v circulair DNA via ligatie
• RE 3 = endonuclease : knipt cirkel + ligeren v 2de set adaptoren
o dit wordt aantal keer herhaalt zodat we circulair dsDNA hebben met # sets v adaptoren
o 1 cirkel = # adaptoren met hiertss telkens een kort stuk oorspronk fragm om te seq
• Rolling circle amplificatie:
o Oorspronkelijke adaptor = bindingsplaats voor polymerase : start amplificatie
o Cirkel : geen stop v amplificatie + meerdere kopies
• Clusters = nanoballs = lange DNA molec met meerdere kopies v template na elkaar
o Deze hybridiseren op vaste drager
4
