Samenvatting Vegetatieve Vermeerdering
Inleiding
Weefselkweek is het kweken van planten(delen) op een kunstmatige
voedingsbodem onder steriele omstandigheden. Ook wel in vitro cultuur in glas.
Hiervoor kan gebruik gemaakt worden van:
- Zaden
- Zaadknoppen
- Embryo’s
- Endosperm
- Meristeem
- Stengel
- Blad
- Mergparenchym
- Bol/knol
- Okselknoppen
- Helmhokjes
- Stuifmeelkorrels
- Losse plantencellen
Welk deel men hiervoor gebruikt is afhankelijk van de plant. Dit deel van de plant
dat gebruikt wordt heet explantaat en wordt op een medium (kunstmatige
voedingsbodem) onder gecontroleerde omstandigheden verder ontwikkeld.
Hiervoor gelden 3 principes:
- De delen van de plant moeten het vermogen hebben om tot een complete
plant uit te groeien (totipotentie).
- De groei- en ontwikkelingsprocessen in vitro moeten gecontroleerd en
gestuurd worden d.m.v. groeiregulatoren. Dit zijn natuurlijke (of
synthetische) plantenhormonen.
- De ontwikkeling van het explantaat is op te vatten als een lange reeks
mitosen die leidt tot een eindproduct. Theoretisch gezien verandert er
dus niks aan het erfelijke materiaal.
Totipotentie:
O.a. een bevruchte eicel en meristematische cellen zijn totipotent -> kunnen nog
alles worden. Somatische cellen (lichaamscellen/vegetatieve cellen) hebben dit
vermogen niet meer -> het genoom blijft wel volledig aanwezig maar wordt
deels geblokkeerd. Door het kiezen van de juiste omstandigheden kan deze
blokkering ongedaan worden -> cellen worden weer totipotent.
De ontwikkelingsmogelijkheden van planten zijn afhankelijk van de volgende
factoren:
- Temperatuur
- Licht
- Gassamenstelling
- Voeding in het medium
- Vitaminen
- Groeiregulatoren
,Deze kunnen bij weefselkweek in principe allemaal in belangrijke mate
gecontroleerd worden.
Callus: min of meer ongedifferentieerd woekerweefsel
Groeiregulatoren:
Spelen een essentiële rol in weefselkweek omdat ze de groei kunnen stimuleren
en ontwikkeling kunnen sturen. Om DNA, en de daarbij horende
ontwikkelingsmogelijkheden, in werking te brengen zijn prikkels nodig:
hormonen. Deze bevinden zich van nature in de plant maar er bestaan ook
synthetische verbindingen die hetzelfde effect hebben -> regulatoren.
De volgende 5 groepen groeiregulatoren zijn belangrijk:
- Auxinen
- Cytokininen
- Gibberallinen
- Abscisinezuur (ABA)
- Ethyleen
Elke regulator heeft specifieke receptoren die op hen reageert die op het
celmembraan zitten of zich in het cytoplasma bevinden. De hormonen worden
normaal gesproken in verschillende hoeveelheden op verschillende plekken
geproduceerd in de plant -> er bestaat een wisselwerking tussen verschillende
organen van de plant. Deze verhoudingen kloppen niet meer bij een explantaat -
> de invloeden van andere organen zijn weggevallen.
Men kan naar keuze groeiregulatoren toevoegen aan het medium. Door
verschillende concentraties toe te voegen van verschillende groeiregulatoren kan
men nagaan welke mogelijkheden de cellen van het explantaat nog hebben.
Skoog en Miller dit getest met een stuk tabaksplant -> hieraan ontstond callus.
Dit werd overgeënt en werden verschillende concentraties auxine en cytokinine
toegevoegd. Dit gaf aan dat de wisselwerking van deze stoffen zorgt voor
bepaalde organen:
- Alleen auxine leidt tot callusgroei
- Auxine met cytokinine leidt tot celdeling -> meer callus
- Auxine > cytokinine leidt tot wortelvorming
- Auxine < cytokinine leidt tot scheutvorming
- Alleen cytokinine doet niks
Deze resultaten gelden voor een tabaksplant -> andere plant = andere
resultaten. De uiterste resultaten gaan echter wel op voor de meeste planten ->
cytokinine stimuleert zijscheuten en auxine induceert wortelvorming. Auxine en
cytokinine zijn antagonisten.
2 factoren van invloed op in vitro cultuur
De factoren die van invloed zijn op de cultuurkweek worden opgedeeld in 3
gebieden:
1. Factoren die te maken hebben met de samenstelling van het medium
2. Factoren die te maken hebben met de keuze van het explantaat
3. De omgevingsfactoren
, Factoren die betrekking hebben op het menselijk handelen (steriel werken bv.)
worden nu niet meegenomen omdat dit teveel factoren zijn.
Medium:
De essentiële bestanddelen van een medium zijn: water, minerale zouten (micro-
en macroelementen) en eventueel agar als het gaat om een vast medium.
Water: gedestilleerd of gedemineraliseerd (i.v.m. ionen die anders het medium
beïnvloeden).
Minerale zouten: het meest gebruikte medium is va M&S en bevat
macrozouten (N.P, K, Ca, Mg en Fe) en microzouten (Mn, Cu, Zn, B, Na, Cl, I, S,
Mo, Co Al en Ni). Voor een zoutarm medium kan de ionenconcentratie 0bepaald
worden.
Agar: bij het bereiden van een vast medium wordt agar toegevoegd als
stolmiddel. Dit kan natuurlijke agar zijn (bereid uit zeewier) en wordt vaak in een
concentratie van 0,7% gebruikt. Er is ook synthetische agar (CASAGAR) en wordt
vaak in een concentratie van 0,2% gebruikt. Het voordeel van synthetische agar
is dat het een constante samenstelling heeft en het minder verontreinigingen
bevat. Synthetische agar is transparant -> is makkelijker bij het opsporen van
infecties. Het gebruik van synthetische agar vereist echter wel aanwezigheid van
voldoende tweewaardige ionen (Ca, Mg) anders vindt er geen stolling plaats. Bij
gebruikelijke media is dit geen probleem maar bij bv. zoutarme media kan beter
gekozen worden voor natuurlijke agar.
Koolstofbron: plantjes in vitro (ten opzichte van in vivo) hebben een
koolstofbron nodig omdat fotosynthese nog niet optimaal is. Er zijn wel
experimenten gedaan waar CO2 toegevoegd werd in de buis waardoor er geen
suiker meer nodig was in het medium. Echter wordt hier niet veel aandacht aan
besteed en wordt er meestal een koolstofbron aan het medium toegevoegd voor
de groei. Hiervoor kan sucrose, glucose en fructose gebruikt worden. suikers zijn
belangrijk voor de energievoorziening maar ook voor de osmotische waarde
en de morfogenese ( het ontstaan van de vorm van een plant).
Vitaminen: in vitro plantjes hebben vitaminen nodig maar kunnen dit bijna altijd
zelf maken zolang er genoeg N is. Soms worden ze uit voorzorg toegevoegd. Veel
gebruikte vitaminen zijn inositol en thiamine.
Hormonen: voor de organogenese zijn hormonen belangrijk (auxine <->
cytokinine)
2,4-D is een synthetische auxine die vaak wordt gebruikt voor de inductie van
callus. Nadelen van deze stof dat het de morfogenese soms remt (of negatief
beïnvloed), het mutaties kan induceren en het fotosynthese geremd wordt.
Het belang van cytokinine in het medium is sterk afhankelijk van het
plantweefsel. Voor sommige is het essentieel en voor sommige niet (wrs
genetisch bepaald). Ook vindt er soms habituatie plaats: na verloop van tijd
hebben culturen geen of minder behoefte aan een bepaalde regulator. Deze
veranderingen zijn wrs epigenetisch -> verandering van genactiviteit gedurende
verschillende fases.
Inleiding
Weefselkweek is het kweken van planten(delen) op een kunstmatige
voedingsbodem onder steriele omstandigheden. Ook wel in vitro cultuur in glas.
Hiervoor kan gebruik gemaakt worden van:
- Zaden
- Zaadknoppen
- Embryo’s
- Endosperm
- Meristeem
- Stengel
- Blad
- Mergparenchym
- Bol/knol
- Okselknoppen
- Helmhokjes
- Stuifmeelkorrels
- Losse plantencellen
Welk deel men hiervoor gebruikt is afhankelijk van de plant. Dit deel van de plant
dat gebruikt wordt heet explantaat en wordt op een medium (kunstmatige
voedingsbodem) onder gecontroleerde omstandigheden verder ontwikkeld.
Hiervoor gelden 3 principes:
- De delen van de plant moeten het vermogen hebben om tot een complete
plant uit te groeien (totipotentie).
- De groei- en ontwikkelingsprocessen in vitro moeten gecontroleerd en
gestuurd worden d.m.v. groeiregulatoren. Dit zijn natuurlijke (of
synthetische) plantenhormonen.
- De ontwikkeling van het explantaat is op te vatten als een lange reeks
mitosen die leidt tot een eindproduct. Theoretisch gezien verandert er
dus niks aan het erfelijke materiaal.
Totipotentie:
O.a. een bevruchte eicel en meristematische cellen zijn totipotent -> kunnen nog
alles worden. Somatische cellen (lichaamscellen/vegetatieve cellen) hebben dit
vermogen niet meer -> het genoom blijft wel volledig aanwezig maar wordt
deels geblokkeerd. Door het kiezen van de juiste omstandigheden kan deze
blokkering ongedaan worden -> cellen worden weer totipotent.
De ontwikkelingsmogelijkheden van planten zijn afhankelijk van de volgende
factoren:
- Temperatuur
- Licht
- Gassamenstelling
- Voeding in het medium
- Vitaminen
- Groeiregulatoren
,Deze kunnen bij weefselkweek in principe allemaal in belangrijke mate
gecontroleerd worden.
Callus: min of meer ongedifferentieerd woekerweefsel
Groeiregulatoren:
Spelen een essentiële rol in weefselkweek omdat ze de groei kunnen stimuleren
en ontwikkeling kunnen sturen. Om DNA, en de daarbij horende
ontwikkelingsmogelijkheden, in werking te brengen zijn prikkels nodig:
hormonen. Deze bevinden zich van nature in de plant maar er bestaan ook
synthetische verbindingen die hetzelfde effect hebben -> regulatoren.
De volgende 5 groepen groeiregulatoren zijn belangrijk:
- Auxinen
- Cytokininen
- Gibberallinen
- Abscisinezuur (ABA)
- Ethyleen
Elke regulator heeft specifieke receptoren die op hen reageert die op het
celmembraan zitten of zich in het cytoplasma bevinden. De hormonen worden
normaal gesproken in verschillende hoeveelheden op verschillende plekken
geproduceerd in de plant -> er bestaat een wisselwerking tussen verschillende
organen van de plant. Deze verhoudingen kloppen niet meer bij een explantaat -
> de invloeden van andere organen zijn weggevallen.
Men kan naar keuze groeiregulatoren toevoegen aan het medium. Door
verschillende concentraties toe te voegen van verschillende groeiregulatoren kan
men nagaan welke mogelijkheden de cellen van het explantaat nog hebben.
Skoog en Miller dit getest met een stuk tabaksplant -> hieraan ontstond callus.
Dit werd overgeënt en werden verschillende concentraties auxine en cytokinine
toegevoegd. Dit gaf aan dat de wisselwerking van deze stoffen zorgt voor
bepaalde organen:
- Alleen auxine leidt tot callusgroei
- Auxine met cytokinine leidt tot celdeling -> meer callus
- Auxine > cytokinine leidt tot wortelvorming
- Auxine < cytokinine leidt tot scheutvorming
- Alleen cytokinine doet niks
Deze resultaten gelden voor een tabaksplant -> andere plant = andere
resultaten. De uiterste resultaten gaan echter wel op voor de meeste planten ->
cytokinine stimuleert zijscheuten en auxine induceert wortelvorming. Auxine en
cytokinine zijn antagonisten.
2 factoren van invloed op in vitro cultuur
De factoren die van invloed zijn op de cultuurkweek worden opgedeeld in 3
gebieden:
1. Factoren die te maken hebben met de samenstelling van het medium
2. Factoren die te maken hebben met de keuze van het explantaat
3. De omgevingsfactoren
, Factoren die betrekking hebben op het menselijk handelen (steriel werken bv.)
worden nu niet meegenomen omdat dit teveel factoren zijn.
Medium:
De essentiële bestanddelen van een medium zijn: water, minerale zouten (micro-
en macroelementen) en eventueel agar als het gaat om een vast medium.
Water: gedestilleerd of gedemineraliseerd (i.v.m. ionen die anders het medium
beïnvloeden).
Minerale zouten: het meest gebruikte medium is va M&S en bevat
macrozouten (N.P, K, Ca, Mg en Fe) en microzouten (Mn, Cu, Zn, B, Na, Cl, I, S,
Mo, Co Al en Ni). Voor een zoutarm medium kan de ionenconcentratie 0bepaald
worden.
Agar: bij het bereiden van een vast medium wordt agar toegevoegd als
stolmiddel. Dit kan natuurlijke agar zijn (bereid uit zeewier) en wordt vaak in een
concentratie van 0,7% gebruikt. Er is ook synthetische agar (CASAGAR) en wordt
vaak in een concentratie van 0,2% gebruikt. Het voordeel van synthetische agar
is dat het een constante samenstelling heeft en het minder verontreinigingen
bevat. Synthetische agar is transparant -> is makkelijker bij het opsporen van
infecties. Het gebruik van synthetische agar vereist echter wel aanwezigheid van
voldoende tweewaardige ionen (Ca, Mg) anders vindt er geen stolling plaats. Bij
gebruikelijke media is dit geen probleem maar bij bv. zoutarme media kan beter
gekozen worden voor natuurlijke agar.
Koolstofbron: plantjes in vitro (ten opzichte van in vivo) hebben een
koolstofbron nodig omdat fotosynthese nog niet optimaal is. Er zijn wel
experimenten gedaan waar CO2 toegevoegd werd in de buis waardoor er geen
suiker meer nodig was in het medium. Echter wordt hier niet veel aandacht aan
besteed en wordt er meestal een koolstofbron aan het medium toegevoegd voor
de groei. Hiervoor kan sucrose, glucose en fructose gebruikt worden. suikers zijn
belangrijk voor de energievoorziening maar ook voor de osmotische waarde
en de morfogenese ( het ontstaan van de vorm van een plant).
Vitaminen: in vitro plantjes hebben vitaminen nodig maar kunnen dit bijna altijd
zelf maken zolang er genoeg N is. Soms worden ze uit voorzorg toegevoegd. Veel
gebruikte vitaminen zijn inositol en thiamine.
Hormonen: voor de organogenese zijn hormonen belangrijk (auxine <->
cytokinine)
2,4-D is een synthetische auxine die vaak wordt gebruikt voor de inductie van
callus. Nadelen van deze stof dat het de morfogenese soms remt (of negatief
beïnvloed), het mutaties kan induceren en het fotosynthese geremd wordt.
Het belang van cytokinine in het medium is sterk afhankelijk van het
plantweefsel. Voor sommige is het essentieel en voor sommige niet (wrs
genetisch bepaald). Ook vindt er soms habituatie plaats: na verloop van tijd
hebben culturen geen of minder behoefte aan een bepaalde regulator. Deze
veranderingen zijn wrs epigenetisch -> verandering van genactiviteit gedurende
verschillende fases.
