Algemene Weefselleer
1 — METHODEN & TECHNIEKEN IN DE HISTOLOGIE
VERSCHILLENDE MICROSCOPISCHE TECHNIEKEN
LICHTMICROSCOOP (LM)
↳ gebruik van zichtbaar licht
◦ stereomicroscoop: licht valt op object zelf & weerkaatst
◦ gewone microscoop met 1 of 2 oculairen & 1 objectief: doorvallend licht
ELEKTRONENMICROSCOOP (EM)
↳ gebruik van elektronenbundel → opp. of inhoud van objecten afbeelden
◦ versnelde elektronen: veel kleinere golflengte dan fotonen → resolutie veel hoger
transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
↳ intracellulaire structuren bestuderen (vergrotingen tot 1 miljoen keer mogelijk)
◦ elektronen doorheen preparaat geschoten & opgevangen op gevoelige plaat
◦ op plaatsen waar preparaat dikst is (veel massa) → meeste verstrooiing vd elektronen
→ aantal elektronen dat uiteindelijk vastgelegd wordt op de gevoelige plaat wordt kleiner
→ gevormde beeld: donkerder in vgl met dunnere plaatsen vh preparaat waar meer
elektronen door kunnen
scanning / surface / raster elektronenmicroscopie (SEM)
↳ opp. van weefsel / structuur van partikel bestuderen (vb. coronavirus)
◦ elektronenstraal tast het opp. af volgens een raster
◦ teruggekaatste elektronen gedetecteerd → punt voor punt vastgelegd in een beeld
◦ detecteerbare laag aanbrengen (dunne laag goudpartikels) op het opp. → elektronen
efficiënter op opp. laten afkaatsen → 3D effecten vh opp.
(vergrotingen van 100.000x mogelijk met resolutie ≈ 1 nm)
RESOLUTIE VAN MICROSCOPEN
Resolutie = de kleinste afstand tussen 2 elementen waarbij ze nog als afzonderlijke
elementen kunnen worden geobserveerd
(LM: 0.2 µm, EM: 0.1 nm)
・λ = golflengte van het ingestraalde licht
・NA = numerieke apertuur (Aₙ) = dimensieloos getal dat aangeeft hoeveel licht een lens
kan opvangen (maw onder welke uiterste hoeken licht opgevangen / uitgestraald kan
worden door deze lens)
,⇒ kracht van een lens ligt in vergroting (magnificatie) van een beeld + kracht om elementen
van elkaar te onderscheiden (resolutie)
WEEFSELPREPARATIE VOOR LICHTMICROSCOPIE
1) Het bewaren & fixeren van weefsels
doel: weefsel bewaren
→ oorspronkelijke toestand (chemisch & structureel) zoveel mogelijk bewaren
→ afbraakprocessen (door intrinsieke & externe factoren) zoveel mogelijk afremmen
→ macromoleculaire structuur zo intact mogelijk houden
afbraakprocessen
☞ gebrek aan aanvoer van O₂, gebrek aan afvoer van afbraakproducten
☞ vrijkomen van verteringsenzymen:
・lytische enzymen in lysosomen
・proteasen vrijgezet door micro-organismen van buitenaf
⟹ afremmen door weefsel fixeren / invriezen → groei micro-organismen uitgeschakeld
methodes
▻ invriezen (enkel geschikt voor kleine weefselstukken)
・weefsel snel ingevroren in OCT oplossing (viskeuze oplossing van glycol & bepaalde soorten hars)
adhv onderkoeld isopentaan (-150°C)
・gesneden in vriescoupes met gekoeld microtoom
・verder gestockeerd in speciale diepvrieskasten op -80°C
→ enzym activiteit sterk vertraagd / stilgelegd, eiwitstructuren ongewijzigd: reversibel
▻ fixeren
・weefsel ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator)
・meest gebruikte fixator: formol = waterige oplossing obv formaldehyde
→ crosslinking: vorming cov bindingen met N-terminale groepen van eiwitten
→ eiwitten hechten vast aan cytoskelet & hun interagerende eiwitten
→ structuur zoveel mogelijk bewaard
→ enzymen irreversibel geïnactiveerd
invriezen fixeren
geen inbedding in paraffine inbedden in paraffine
snijden met vriesmicrotoom snijden met microtoom
procedure 10-15 min procedure 2-36 uur
variabel resultaat constante resultaten
minder goede morfologie goede morfologie
DNA, RNA bewaard DNA, RNA beschadigd
enzym activiteit bewaard enzymen verliezen activiteit
moeilijk / kostelijk om te stockeren gemakkelijk te stockeren
,2) Het vervaardigen van weefselsneden
▻ ingevroren materiaal kan direct aangesneden worden op speciaal vriesmicrotoom
→ weefsel blijft ingevroren
▻ gefixeerd materiaal: zacht, kan niet direct gesneden worden → inbedden in paraffine
・fixatieven (watergebaseerd): niet zomaar vermengen met paraffine (hydrofoob)
・materiaal eerst ontdaan van water ☞ weefsel in oplopende concentratiegradiënt
van alcoholoplossingen plaatsen
・uitspoelen met tolueen / xyleen: hydrofoob → doorweken met warme, vloeibare paraffine
verzekeren
・eens paraffine opgesteven → snijdbare blok → coupes snijden op microtoom
3) Het kleuren van weefselsneden
◦ meeste kleurstoffen = wateroplosbaar → paraffine opnieuw verwijderen uit weefsel:
zelfde proces als inbedding in omgekeerde volgorde: (paraffine-xyleen-alcohol-water)
・paraffine oplossen met xyleen
・xyleen uitgespoeld met alcohol (dalende gradiënt: bv. 90% ethanol, 80% ethanol…)
・weefsel helemaal rehydrateren met water → kleuren
◦ na kleuren → coupes afdekken → permanent bewaren & onder microscoop bekijken
(coupes na kleuren terug ontwateren)
EMPIRISCHE KLEURING: H&E KLEURING (zelf kleur toevoegen)
↳ standaard basis kleuring voor histologisch & pathologisch onderzoek
↳ ontdekt door “trial & error”
◦ Haematoxyline: blauwe, basische kleurstof, ⊕ geladen → bindt aan zure elementen
(hoge concentratie zuren in kern: (deoxy)ribunocleïnezuur)
◦ Eosine: rode, zure kleurstof, ⊖ geladen → bindt aan basische elementen
(bestanddelen uit cytoplasma, collageen in extracellulaire matrix: overwegend basisch)
HISTOCHEMISCHE KLEURING
↳ specifieke chemische reactie van weefselcomponent met een chemische verbinding in de
kleuroplossing
vb. “Periodic Acid Schiff” kleuring (PAS) → aanwezigheid koolhydraten aantonen
(koolhydraten komen in ≠ vormen voor: alle types sachariden, proteoglycanen, glycoproteïnen, mucines..)
◦ reagens bestaat uit: periodaat (HIO₄) en Schiffs reagens
◦ kleuring obv oxidatieve eigenschappen van HIO₄: oxideert glycol groepen in suikers tot
aldehyden → aldehydegroepen magentarood gekleurd met Schiffs reagens
, ENZYMHISTOCHEMISCHE KLEURING (enzymen al natuurlijk aanwezig in cellen)
↳ gebruik van enzymactiviteit aanwezig in weefsel
voorwaarde: enzymatische activiteit blijft bewaard tijdens weefselvoorbereiding
・enkel uitgevoerd op vriescoupes
・zichtbaar eindproduct genereren van enzymatische reactie ☞ lokaal zichtbare neerslag op
plaatsen waar enzym zich bevindt
→ aanwezigheid & activiteit van specifieke enzymen in weefsels & cellen detecteren
vb. peroxidase kleuring
◦ komt voor in meeste cellen in ons lichaam & aanwezig in peroxisomen
◦ in aanwezigheid van H₂O₂: peroxidase oxideert substraat: diaminobenzidine
tetrahydrochloride (DAB) → geoxideerd tot bruine neerslag
→ cellen met veel peroxisomen / peroxidase activiteit kleuren bruin
IMMUNOHISTOCHEMISCHE KLEURING (meest gebruikt)
↳ gebruik van eigenschappen van immunologische componenten → bepaalde factoren
detecteren in staal (onderzoek op eiwitniveau)
→ aantonen & lokaliseren van antigeen (eiwitten) mbv specifieke antistoffen (AS) in
weefselcoupes
◦ antilichamen gebruiken als technologische toepassing (niks te maken met immuunreactie in lichaam)
↳ structuur: 2 handen per antilichaam specifiek voor 1 bepaalde eiwit
◦ affiniteit van antistof = sterkte van AS-AG binding (hoe beter AS op AG past, hoe beter affiniteit)
◦ specificiteit = mate waarin een AS bindt aan 1 enkel epitoop en minder / niet aan anderen
◦ sensitiviteit = relatieve hoeveelheid AG dat opgespoord kan worden → hoe hoger
sensitiviteit van techniek om eenzelfde hoeveelheid AG op te sporen, hoe sterker reactie
◦ commercieel aangekocht: preparaat van AG inspuiten in muis
▻ polyklonaal AS: serum gecollecteerd van muis met complex mengsel van ≠ AS
↳ herkennen ≠ epitopen op AG
▻ monoklonaal AS: specifieke AS artificieel produceren via hybridoma technologie:
plasmacellen (maken AS aan) gecollecteerd & gehybridiseerd met myeloma
kankercellen tot hybridomas → produceren telkens 1 specifiek AS → selecteren
obv eigenschappen om te binden aan bepaald epitoop
↳ herkennen specifiek 1 epitoop
1 — METHODEN & TECHNIEKEN IN DE HISTOLOGIE
VERSCHILLENDE MICROSCOPISCHE TECHNIEKEN
LICHTMICROSCOOP (LM)
↳ gebruik van zichtbaar licht
◦ stereomicroscoop: licht valt op object zelf & weerkaatst
◦ gewone microscoop met 1 of 2 oculairen & 1 objectief: doorvallend licht
ELEKTRONENMICROSCOOP (EM)
↳ gebruik van elektronenbundel → opp. of inhoud van objecten afbeelden
◦ versnelde elektronen: veel kleinere golflengte dan fotonen → resolutie veel hoger
transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
↳ intracellulaire structuren bestuderen (vergrotingen tot 1 miljoen keer mogelijk)
◦ elektronen doorheen preparaat geschoten & opgevangen op gevoelige plaat
◦ op plaatsen waar preparaat dikst is (veel massa) → meeste verstrooiing vd elektronen
→ aantal elektronen dat uiteindelijk vastgelegd wordt op de gevoelige plaat wordt kleiner
→ gevormde beeld: donkerder in vgl met dunnere plaatsen vh preparaat waar meer
elektronen door kunnen
scanning / surface / raster elektronenmicroscopie (SEM)
↳ opp. van weefsel / structuur van partikel bestuderen (vb. coronavirus)
◦ elektronenstraal tast het opp. af volgens een raster
◦ teruggekaatste elektronen gedetecteerd → punt voor punt vastgelegd in een beeld
◦ detecteerbare laag aanbrengen (dunne laag goudpartikels) op het opp. → elektronen
efficiënter op opp. laten afkaatsen → 3D effecten vh opp.
(vergrotingen van 100.000x mogelijk met resolutie ≈ 1 nm)
RESOLUTIE VAN MICROSCOPEN
Resolutie = de kleinste afstand tussen 2 elementen waarbij ze nog als afzonderlijke
elementen kunnen worden geobserveerd
(LM: 0.2 µm, EM: 0.1 nm)
・λ = golflengte van het ingestraalde licht
・NA = numerieke apertuur (Aₙ) = dimensieloos getal dat aangeeft hoeveel licht een lens
kan opvangen (maw onder welke uiterste hoeken licht opgevangen / uitgestraald kan
worden door deze lens)
,⇒ kracht van een lens ligt in vergroting (magnificatie) van een beeld + kracht om elementen
van elkaar te onderscheiden (resolutie)
WEEFSELPREPARATIE VOOR LICHTMICROSCOPIE
1) Het bewaren & fixeren van weefsels
doel: weefsel bewaren
→ oorspronkelijke toestand (chemisch & structureel) zoveel mogelijk bewaren
→ afbraakprocessen (door intrinsieke & externe factoren) zoveel mogelijk afremmen
→ macromoleculaire structuur zo intact mogelijk houden
afbraakprocessen
☞ gebrek aan aanvoer van O₂, gebrek aan afvoer van afbraakproducten
☞ vrijkomen van verteringsenzymen:
・lytische enzymen in lysosomen
・proteasen vrijgezet door micro-organismen van buitenaf
⟹ afremmen door weefsel fixeren / invriezen → groei micro-organismen uitgeschakeld
methodes
▻ invriezen (enkel geschikt voor kleine weefselstukken)
・weefsel snel ingevroren in OCT oplossing (viskeuze oplossing van glycol & bepaalde soorten hars)
adhv onderkoeld isopentaan (-150°C)
・gesneden in vriescoupes met gekoeld microtoom
・verder gestockeerd in speciale diepvrieskasten op -80°C
→ enzym activiteit sterk vertraagd / stilgelegd, eiwitstructuren ongewijzigd: reversibel
▻ fixeren
・weefsel ondergedompeld in fixatievloeistof (fixator)
・meest gebruikte fixator: formol = waterige oplossing obv formaldehyde
→ crosslinking: vorming cov bindingen met N-terminale groepen van eiwitten
→ eiwitten hechten vast aan cytoskelet & hun interagerende eiwitten
→ structuur zoveel mogelijk bewaard
→ enzymen irreversibel geïnactiveerd
invriezen fixeren
geen inbedding in paraffine inbedden in paraffine
snijden met vriesmicrotoom snijden met microtoom
procedure 10-15 min procedure 2-36 uur
variabel resultaat constante resultaten
minder goede morfologie goede morfologie
DNA, RNA bewaard DNA, RNA beschadigd
enzym activiteit bewaard enzymen verliezen activiteit
moeilijk / kostelijk om te stockeren gemakkelijk te stockeren
,2) Het vervaardigen van weefselsneden
▻ ingevroren materiaal kan direct aangesneden worden op speciaal vriesmicrotoom
→ weefsel blijft ingevroren
▻ gefixeerd materiaal: zacht, kan niet direct gesneden worden → inbedden in paraffine
・fixatieven (watergebaseerd): niet zomaar vermengen met paraffine (hydrofoob)
・materiaal eerst ontdaan van water ☞ weefsel in oplopende concentratiegradiënt
van alcoholoplossingen plaatsen
・uitspoelen met tolueen / xyleen: hydrofoob → doorweken met warme, vloeibare paraffine
verzekeren
・eens paraffine opgesteven → snijdbare blok → coupes snijden op microtoom
3) Het kleuren van weefselsneden
◦ meeste kleurstoffen = wateroplosbaar → paraffine opnieuw verwijderen uit weefsel:
zelfde proces als inbedding in omgekeerde volgorde: (paraffine-xyleen-alcohol-water)
・paraffine oplossen met xyleen
・xyleen uitgespoeld met alcohol (dalende gradiënt: bv. 90% ethanol, 80% ethanol…)
・weefsel helemaal rehydrateren met water → kleuren
◦ na kleuren → coupes afdekken → permanent bewaren & onder microscoop bekijken
(coupes na kleuren terug ontwateren)
EMPIRISCHE KLEURING: H&E KLEURING (zelf kleur toevoegen)
↳ standaard basis kleuring voor histologisch & pathologisch onderzoek
↳ ontdekt door “trial & error”
◦ Haematoxyline: blauwe, basische kleurstof, ⊕ geladen → bindt aan zure elementen
(hoge concentratie zuren in kern: (deoxy)ribunocleïnezuur)
◦ Eosine: rode, zure kleurstof, ⊖ geladen → bindt aan basische elementen
(bestanddelen uit cytoplasma, collageen in extracellulaire matrix: overwegend basisch)
HISTOCHEMISCHE KLEURING
↳ specifieke chemische reactie van weefselcomponent met een chemische verbinding in de
kleuroplossing
vb. “Periodic Acid Schiff” kleuring (PAS) → aanwezigheid koolhydraten aantonen
(koolhydraten komen in ≠ vormen voor: alle types sachariden, proteoglycanen, glycoproteïnen, mucines..)
◦ reagens bestaat uit: periodaat (HIO₄) en Schiffs reagens
◦ kleuring obv oxidatieve eigenschappen van HIO₄: oxideert glycol groepen in suikers tot
aldehyden → aldehydegroepen magentarood gekleurd met Schiffs reagens
, ENZYMHISTOCHEMISCHE KLEURING (enzymen al natuurlijk aanwezig in cellen)
↳ gebruik van enzymactiviteit aanwezig in weefsel
voorwaarde: enzymatische activiteit blijft bewaard tijdens weefselvoorbereiding
・enkel uitgevoerd op vriescoupes
・zichtbaar eindproduct genereren van enzymatische reactie ☞ lokaal zichtbare neerslag op
plaatsen waar enzym zich bevindt
→ aanwezigheid & activiteit van specifieke enzymen in weefsels & cellen detecteren
vb. peroxidase kleuring
◦ komt voor in meeste cellen in ons lichaam & aanwezig in peroxisomen
◦ in aanwezigheid van H₂O₂: peroxidase oxideert substraat: diaminobenzidine
tetrahydrochloride (DAB) → geoxideerd tot bruine neerslag
→ cellen met veel peroxisomen / peroxidase activiteit kleuren bruin
IMMUNOHISTOCHEMISCHE KLEURING (meest gebruikt)
↳ gebruik van eigenschappen van immunologische componenten → bepaalde factoren
detecteren in staal (onderzoek op eiwitniveau)
→ aantonen & lokaliseren van antigeen (eiwitten) mbv specifieke antistoffen (AS) in
weefselcoupes
◦ antilichamen gebruiken als technologische toepassing (niks te maken met immuunreactie in lichaam)
↳ structuur: 2 handen per antilichaam specifiek voor 1 bepaalde eiwit
◦ affiniteit van antistof = sterkte van AS-AG binding (hoe beter AS op AG past, hoe beter affiniteit)
◦ specificiteit = mate waarin een AS bindt aan 1 enkel epitoop en minder / niet aan anderen
◦ sensitiviteit = relatieve hoeveelheid AG dat opgespoord kan worden → hoe hoger
sensitiviteit van techniek om eenzelfde hoeveelheid AG op te sporen, hoe sterker reactie
◦ commercieel aangekocht: preparaat van AG inspuiten in muis
▻ polyklonaal AS: serum gecollecteerd van muis met complex mengsel van ≠ AS
↳ herkennen ≠ epitopen op AG
▻ monoklonaal AS: specifieke AS artificieel produceren via hybridoma technologie:
plasmacellen (maken AS aan) gecollecteerd & gehybridiseerd met myeloma
kankercellen tot hybridomas → produceren telkens 1 specifiek AS → selecteren
obv eigenschappen om te binden aan bepaald epitoop
↳ herkennen specifiek 1 epitoop
