HC 1 Gene-editing
CRISPR-CAS (cluster of regularly interspaced short palindromic repeats)
Genonderzoek evolueerde in de loop van de tijd tot steeds efficiëntere technieken:
1. Willekeurige mutaties door straling.
2. Knock-out muizen (KO)
3. Knock-in muizen (KI)
4. Dubbel/tripel KO muizen (meerdere genen)
5. CRISPR-CAS (goedkoop en makkelijk).
CRISPR-CAS is van origine een bacterieel afweersysteem. Wanneer een virus een bacterie aanvalt,
komt viraal DNA in de bacterie. Virussen kunnen zo reproduceren, maar met behulp van CAS kan
viraal DNA geknipt worden ter verdediging. CAS bestaat uit twee knip domeinen.
Wat heb je nodig:
1. crRNA + tracer RNA → single guide RNA (sgRNA)/tracerRNA
2. CAS9 eiwit
3. DNA
PAM sequentie: een sequentie die wordt herkend door Cas9. Het
herkent de sequentie 5’-NGG-3’ (komt iedere 8-12bp voor in het
humane genoom).
Controles
− Positieve controle: een sgRNA gebruiken waarvan je weet
dat de sequentie zal knippen in het genoom en het
resultaat vergelijkt met eventueel een voorgaand
experiment.
− Negatieve controle: niet bindende sgRNA’s
Je kan door middel van kloneren plasmiden maken en inbouwen in
cellen. Elke cel kan het plasmide aflezen, mits er een goede
promoter is gebruikt.
,Het CAS-eiwit zal 4-6bp wegknippen en er ontstaat altijd een dubbelstrengs DNA breuk. Er zijn twee
manieren voor de cel om dit op te lossen.
− Non homologous end joining (NHEJ): De uiteinden worden simpelweg aan elkaar geplakt. Dit
kan leiden tot een frameshift, insersties en deleties. Er worden vaak meerdere targets
gemaakt tegen meerdere genen en plaatsen binnen de genen. Zo wordt met grote zekerheid
een gen uitgezet (KO) waarmee de functie van het gen kan worden onderzocht. De grote
vraag is of de cel hierna nog kan delen en differentiëren en of er bepaalde cellulaire
pathways stop gezet zijn.
− Homology directed repair: er wordt in overmaat donor DNA toegevoegd dat aan de flanken
complementair is met het genoom. Dit DNA wordt door de cel ingebouwd, waarmee
specifieke puntmutaties kunnen worden onderzocht. Dit wordt ook gebruikt voor KO’s, KI’s,
gene tagging, inserties en deleties en promoter onderzoek.
CRISPR-CAS kent veel meer toepassingen:
1. Gen regulatie
a. Repressor domein
b. Activator domein
2. Cargo delivery
a. Fluorescentie
b. DNA methylase
3. RNA cleavage (inactivatie)
Nadelen van CRISPR-CAS:
-off target effects, dat betekent dat er
ook DNA wordt geknipt die je niet wilde
(homologen). Soms kan dit per onderzoek
meer dan 100 keer voorkomen.
, HC 2 CRISPR Cas & prokaryoten
Het einde van het antibioticatijdperk door vele resistentiemechanismen is nabij. Resistentie is al
duizenden jaren bezig door de interactie van bacteriën met schimmels/(planten).
De oplossing voor resistentie begint in Georgië. Europa wilde
hun antibiotica niet aan de Sovjet-Unie geven. Daarom begon de
Sovjet-Unie zelf met ontwikkelingen. Zij experimenteerde met
bacteriofagen. Er zijn lytische fagen en lysogene fagen.
Nadelen:
1. Bacteriofagen tegen E. coli moorden ook de darmflora.
2. Er is geen farmaceut die hier geld mee kan verdienen
omdat het een bestand idee is.
Oplossing: bacteriofaagtherapie + CRISPR Cas.
Eukaryoten reparatiemechanismen:
− Non-homoloog
− Homoloog
Bacteriën
− Target op het chromosoom → bacterie gaat dood
− Target op het plasmide → plasmide verdwijnt en de
bacterie blijft in leven
Onderzoek 1
Er is een plasmide ontworpen speciaal om in bacteriën te
transfecteren. Het plasmide werd getransfecteerd in
cellen met resistentie voor kanamycine en cellen zonder
resistentie.
− De kan-resistente bacteriën stierven, omdat
CRISPR-Cas kon knippen.
− De kan-gevoelige bacteriën bleven leven, omdat
CRISPR-Cas niet kon knippen.
− Controle: bacteriën zonder het plasmide: blijven
leven.
Onderzoek 2
Er werd een mengcultuur gemaakt van S. aureus
bacteriën met en zonder aph-gen. Het doel was om in
CRISPR-CAS (cluster of regularly interspaced short palindromic repeats)
Genonderzoek evolueerde in de loop van de tijd tot steeds efficiëntere technieken:
1. Willekeurige mutaties door straling.
2. Knock-out muizen (KO)
3. Knock-in muizen (KI)
4. Dubbel/tripel KO muizen (meerdere genen)
5. CRISPR-CAS (goedkoop en makkelijk).
CRISPR-CAS is van origine een bacterieel afweersysteem. Wanneer een virus een bacterie aanvalt,
komt viraal DNA in de bacterie. Virussen kunnen zo reproduceren, maar met behulp van CAS kan
viraal DNA geknipt worden ter verdediging. CAS bestaat uit twee knip domeinen.
Wat heb je nodig:
1. crRNA + tracer RNA → single guide RNA (sgRNA)/tracerRNA
2. CAS9 eiwit
3. DNA
PAM sequentie: een sequentie die wordt herkend door Cas9. Het
herkent de sequentie 5’-NGG-3’ (komt iedere 8-12bp voor in het
humane genoom).
Controles
− Positieve controle: een sgRNA gebruiken waarvan je weet
dat de sequentie zal knippen in het genoom en het
resultaat vergelijkt met eventueel een voorgaand
experiment.
− Negatieve controle: niet bindende sgRNA’s
Je kan door middel van kloneren plasmiden maken en inbouwen in
cellen. Elke cel kan het plasmide aflezen, mits er een goede
promoter is gebruikt.
,Het CAS-eiwit zal 4-6bp wegknippen en er ontstaat altijd een dubbelstrengs DNA breuk. Er zijn twee
manieren voor de cel om dit op te lossen.
− Non homologous end joining (NHEJ): De uiteinden worden simpelweg aan elkaar geplakt. Dit
kan leiden tot een frameshift, insersties en deleties. Er worden vaak meerdere targets
gemaakt tegen meerdere genen en plaatsen binnen de genen. Zo wordt met grote zekerheid
een gen uitgezet (KO) waarmee de functie van het gen kan worden onderzocht. De grote
vraag is of de cel hierna nog kan delen en differentiëren en of er bepaalde cellulaire
pathways stop gezet zijn.
− Homology directed repair: er wordt in overmaat donor DNA toegevoegd dat aan de flanken
complementair is met het genoom. Dit DNA wordt door de cel ingebouwd, waarmee
specifieke puntmutaties kunnen worden onderzocht. Dit wordt ook gebruikt voor KO’s, KI’s,
gene tagging, inserties en deleties en promoter onderzoek.
CRISPR-CAS kent veel meer toepassingen:
1. Gen regulatie
a. Repressor domein
b. Activator domein
2. Cargo delivery
a. Fluorescentie
b. DNA methylase
3. RNA cleavage (inactivatie)
Nadelen van CRISPR-CAS:
-off target effects, dat betekent dat er
ook DNA wordt geknipt die je niet wilde
(homologen). Soms kan dit per onderzoek
meer dan 100 keer voorkomen.
, HC 2 CRISPR Cas & prokaryoten
Het einde van het antibioticatijdperk door vele resistentiemechanismen is nabij. Resistentie is al
duizenden jaren bezig door de interactie van bacteriën met schimmels/(planten).
De oplossing voor resistentie begint in Georgië. Europa wilde
hun antibiotica niet aan de Sovjet-Unie geven. Daarom begon de
Sovjet-Unie zelf met ontwikkelingen. Zij experimenteerde met
bacteriofagen. Er zijn lytische fagen en lysogene fagen.
Nadelen:
1. Bacteriofagen tegen E. coli moorden ook de darmflora.
2. Er is geen farmaceut die hier geld mee kan verdienen
omdat het een bestand idee is.
Oplossing: bacteriofaagtherapie + CRISPR Cas.
Eukaryoten reparatiemechanismen:
− Non-homoloog
− Homoloog
Bacteriën
− Target op het chromosoom → bacterie gaat dood
− Target op het plasmide → plasmide verdwijnt en de
bacterie blijft in leven
Onderzoek 1
Er is een plasmide ontworpen speciaal om in bacteriën te
transfecteren. Het plasmide werd getransfecteerd in
cellen met resistentie voor kanamycine en cellen zonder
resistentie.
− De kan-resistente bacteriën stierven, omdat
CRISPR-Cas kon knippen.
− De kan-gevoelige bacteriën bleven leven, omdat
CRISPR-Cas niet kon knippen.
− Controle: bacteriën zonder het plasmide: blijven
leven.
Onderzoek 2
Er werd een mengcultuur gemaakt van S. aureus
bacteriën met en zonder aph-gen. Het doel was om in
