Praktijk Course 5 blok 1
Nora Faro
BML2D
2023
1
,Inhoudsopgave
Inhoudsopgave....................................................................................................................... 2
Inleiding.................................................................................................................................. 3
Vector en mutatie................................................................................................................... 3
Standaard PCR...................................................................................................................... 5
PCR zuivering........................................................................................................................ 9
DNA concentratie en zuiverheid...........................................................................................10
Plasmide isolatie................................................................................................................... 11
Gel zuivering........................................................................................................................ 12
Restrictie enzym digestie......................................................................................................13
Ligatie................................................................................................................................... 15
Transformatie in E. coli TOP10 cellen..................................................................................15
Kolonie PCR......................................................................................................................... 17
Transformatie in BL21 (DE3) cellen......................................................................................18
2
, Inleiding
In course 5 wordt het effect van een mutatie in het gen dat codeert voor het enzym isocitraat
dehydrogenase-1 (IDH1) op de enzymatische functie onderzocht. Dit enzym is onderdeel
van de citroenzuurcyclus; de metabolische route van aerobe organismen waarbij er door
oxidatie van kleine organische moleculen energie ontstaat, in de vorm van ATP, NADH en
FAD. De restproducten van deze cyclus zijn CO2 en H2O. IDH1 is het enzym dat zorgt voor
de omzetting van isocitraat in 𝝰-ketoglutaraat. Hierbij ontstaat NADH. Mutaties in het gen
dat codeert voor IDH1 zijn oncogeen, en zorgen onder andere voor het ontstaan van
glioblastoma. Dit zijn agressieve hersentumoren. In de praktijk van course 5 wordt er
gewerkt met drie verschillende mutaties en vectoren. Het gen bestaat uit cDNA, dit is DNA
dat door reverse transcriptase is afgeschreven van mRNA. Hierdoor bevat het geen
intronen. Het IDH1 insert wordt in de vector geplaatst. De host cel zal veel kopieën gaan
maken van de plasmide, waardoor er een grotere hoeveelheid van het gen ontstaat
Vector en mutatie
pGEX-4T1
- Tac promotor: promotor gemaakt uit combinatie van trp, en lac.
- 4969 bp.
- GST tag: glutathione S-transferase (26 kDa), sequentie die expressievectoren vaak
bevatten. De GST tag bindt aan de N-terminus van het (fusie)eiwit. GST zorgt ervoor
dat het eiwit direct na translatie in een stabiele, oplosbare vorm vouwt. Hierdoor is de
yield van eiwitexpressie hoger.
- Ampicilline resistentie: Door het amp gen is de plasmide resistent tegen ampicilline.
- IPTG inducer: IPTG is een voorloper molecuul van allolactose, dit is het inducer
molecuul van het lac-operon. Doordat de tac-promotor deels lac is, is het
induceerbaar door IPTG.
pBad/His
- araBAD promotor: onderdeel van het arabinose operon.
- 4103 bp.
3
Nora Faro
BML2D
2023
1
,Inhoudsopgave
Inhoudsopgave....................................................................................................................... 2
Inleiding.................................................................................................................................. 3
Vector en mutatie................................................................................................................... 3
Standaard PCR...................................................................................................................... 5
PCR zuivering........................................................................................................................ 9
DNA concentratie en zuiverheid...........................................................................................10
Plasmide isolatie................................................................................................................... 11
Gel zuivering........................................................................................................................ 12
Restrictie enzym digestie......................................................................................................13
Ligatie................................................................................................................................... 15
Transformatie in E. coli TOP10 cellen..................................................................................15
Kolonie PCR......................................................................................................................... 17
Transformatie in BL21 (DE3) cellen......................................................................................18
2
, Inleiding
In course 5 wordt het effect van een mutatie in het gen dat codeert voor het enzym isocitraat
dehydrogenase-1 (IDH1) op de enzymatische functie onderzocht. Dit enzym is onderdeel
van de citroenzuurcyclus; de metabolische route van aerobe organismen waarbij er door
oxidatie van kleine organische moleculen energie ontstaat, in de vorm van ATP, NADH en
FAD. De restproducten van deze cyclus zijn CO2 en H2O. IDH1 is het enzym dat zorgt voor
de omzetting van isocitraat in 𝝰-ketoglutaraat. Hierbij ontstaat NADH. Mutaties in het gen
dat codeert voor IDH1 zijn oncogeen, en zorgen onder andere voor het ontstaan van
glioblastoma. Dit zijn agressieve hersentumoren. In de praktijk van course 5 wordt er
gewerkt met drie verschillende mutaties en vectoren. Het gen bestaat uit cDNA, dit is DNA
dat door reverse transcriptase is afgeschreven van mRNA. Hierdoor bevat het geen
intronen. Het IDH1 insert wordt in de vector geplaatst. De host cel zal veel kopieën gaan
maken van de plasmide, waardoor er een grotere hoeveelheid van het gen ontstaat
Vector en mutatie
pGEX-4T1
- Tac promotor: promotor gemaakt uit combinatie van trp, en lac.
- 4969 bp.
- GST tag: glutathione S-transferase (26 kDa), sequentie die expressievectoren vaak
bevatten. De GST tag bindt aan de N-terminus van het (fusie)eiwit. GST zorgt ervoor
dat het eiwit direct na translatie in een stabiele, oplosbare vorm vouwt. Hierdoor is de
yield van eiwitexpressie hoger.
- Ampicilline resistentie: Door het amp gen is de plasmide resistent tegen ampicilline.
- IPTG inducer: IPTG is een voorloper molecuul van allolactose, dit is het inducer
molecuul van het lac-operon. Doordat de tac-promotor deels lac is, is het
induceerbaar door IPTG.
pBad/His
- araBAD promotor: onderdeel van het arabinose operon.
- 4103 bp.
3
