MOLECULAIRE BIOLOGIE VAN DE CEL (DEEL 2)
VESCULAIR TRANSPORT (H13)
• Membranen katalyseren chemische reacties door
bepaalde componenten te concentreren.
• Membraansystemen houden contact d.m.v.
vesiculair transport. Hierdoor worden membraan
componenten uitgewisseld zonder dat de identiteit
van het compartiment verloren gaat.
• Secretoire route: membraancompartiment die met
elkaar verbonden zijn via vesiculair transport (ER, golgi,
plasmamembraan, endosomen en lysosomen).
• Transport kan niet één kant op gaan, want dan zal een
membraancompartiment verloren gaan. Retrieval is een
vorm van transport terug naar het ER, zodat lipiden en
eiwitten worden aangevuld.
• In het rood staat uitwisseling via exocytose, in het groen
via endocytose en in het blauw via retrieval weergegeven
Maken van een vesicle
• Het is energetisch gunstig voor een membraan
om plat te zijn; dus het kost energie om een
vesicle te vormen.
• M.b.v. coat-eiwitten krijgt het membraan een
kromming en wordt het juiste molecuul
geconcentreerd in de vesicle. Deze eiwitten
binden aan de cytoplasmatische kant van het
membraan.
• Functies van coat:
o Selecteert cargomoleculen
o Buigt het membraan
Types coated vesicles
• COPI: tussen de verschillende golgi cisternae
• COPII: van het ER naar het golgi
• Clathrine: om endosomen te maken of om bepaalde
vesicles vanuit het golgi te transporteren naar het endo- en
lysosoom
o Clathrin coat heeft 2 lagen:
- Adapter eiwitten: selectie van cargo receptoren:
receptoren die transmembraan moleculen kunnen
vangen en concentreren.
- Membraan curvatuur: clathrin triskelions, deze
vormen een soort mandje waardoor de vesicle stabieler is
Hoe monteer je een coat op een specifieke plaats?
• Om een vesicle te maken zijn de fosfatidylinosotol lipiden van belang (glycerol, alcohol met 3 OH
groepen, en een fosfaat)
• De inosotol kan gefosforyleerd worden op verschillende plekken waardoor er verschillende typen
fosfatidylinostol ontstaan
, o PIP4: fosfaat op de 4e plek gezet
• Er zijn eiwitten in de cel die speciaal aan deze kopgroepen binden afhankelijk van welke
fosfaatgroepen op welke plekken zitten.
• Er zijn specifieke kinase en fosfatases die het specifiek fosforyleren.
• Elk membraan compartiment in de cel heeft verrijking in speciale vorm van fosfoinosotiden.
• Een clatherin adaptor eiwit (AP2) is gevoelig voor twee dingen; de specifieke lipiden (PI(4,5)P2)
en de cargo receptoren; het is een coincidence receptor. Als het beide kan binden wordt het
actief en gaat het open als het ware.
• De vorming van de vesicles berust vaak op kleine GTPases:
In het geval van COPII vesicles is hun eerste laag G-adaptine en
een kleine GTP-ase (Sar1). Deze bindt alleen in de GTP gebonden
vorm aan de membraan (na GEF activatie dus). Sar1-GEF is dan
membraangebonden (door amfipatische helix) en kan Sar-1GDP
omzetten naar Sar1-GTP die ook in de membraan zit. Die kan
COPII herkennen. Na de binding zijn de eiwitten Sec23/Sec24
aanwezig die de eerste laag maken door te binden met de
cargoreceptor. De membraan moet dan gebogen worden, dit
gebeurt vaak door coiled coils die binden en dan duwen. Dan moet de
tweede laag gevormd worden. In het geval van clatherine is het een soort
rieten mand. Het zijn clathrin triskelions die de vesiculaire structuur maken.
Deze triskelions hebben symmetrie en polymeriseren in de mand achtige
structuur.
• Voor de COPII vesicles zijn de Sec13/Sec31 belangrijk voor het maken van
de tweede laag. Ook deze maken een soort rieten mand structuur om
de membraan te buigen. Dit proces gaat beter wanneer de membraan
al gebogen wordt, hier helpen de BAR eiwitten bij.
o BAR domein kan goed binden aan het membraan en heeft een
gebogen structuur -> kan membraan gebogen maken
• Samen met de eerste laag van de coat wordt de curvatuur van de
membraan bewerkstelligt.
• Niet alle soorten stoffen kunnen in een vesicle zoals bijvoorbeeld
collageenfibrillen. Deze worden in de vorm van procollageen gemaakt
en dan moet het coating proces aangepast worden. Daarvoor zijn
specifieke packaging proteins die aangepast worden door bv. ubiquitine.
Er wordt dan een hele lange structuur gevormd.
,Afsnoeren van het vesicle
• In het geval van clathrine is er een specifieke GTPase, dynamine, die een spiraal om de
nek van de vesicle maakt.
• Het membraan wordt dat dicht bij elkaar gebracht en lipide worden gemodificeerd en
het vesicle wordt afgesnoerd mbv hydrolyse (energie gebruikt om af te snoeren).
• Dus Dynamin en geassocieerde eiwitten:
o Vervorming van het membraan
o Lipide modificaties
Vesicle uncoating
Als het vesicle bij de bestemming is, moet de coat eraf. Het is daarom heel erg
belangrijk dat het maken van de coat een reversibel proces is.
1. Hydrolyse van PI(4,5)P2 door een specifiek fosfatase (AP2-binding is
verzwakt)
2. GTP-hydrolyse door GTPase voor coat werving
3. Membraan curvatuur kan een GAP activeren voor coat recruitment GTPase
ARF
4. Uncoating ATPase (hsp70 chaperon): gepolymeriseerde eiwitten (tweede
laag) worden weggehaald door chaperonne eiwitten.
Samenvatting: Vesicle maken
• Cargoselectie en coat assemblage
o Cargo receptoren
o Lipidensamenstelling
o Coat rekrutering GTPasen
o Membraanbuigende eiwitten (bv. Coat)
o Verpakkingseiwitten, coat modificaties
• Afsnoeren (pinching off) van het vesicle
o GTPase dynamin
o Lipidenmodificaties
• Ontmantelen van het vesicle
o Lipidensamenstelling, kromming/curvatuur
o GTPase activiteit
o ATPase (chaperon)
o Coat fosforylering
Een vesicle targetten naar de juiste locatie
• Ook bij het targeten spelen GTPases een belangrijke rol bij, dit zijn
de Rab-GTPases
• Het principe is hetzelfde; inactief in de GDP gebonden
vorm en actief in de GTP gebonden vorm door GAP en
GEF.
• De actieve Rab-GTP (in de membraan) kan dan binden
aan motor-eiwitten of aan eiwitten die fusie
bevorderen.
• Het vesicle is gemaakt en dan wordt het Rab eiwit
gerekruteerd wat kan zorgen voor transport of
tethering.
• Aan de target membraan zijn lange eiwitten die als een
soort armpjes zwaaien die het vesicle kunnen vangen.
, Als het gevangen is wordt het dicht in de buurt van de membraan gebracht, docking. Dan komen
de eiwitten die fusie reguleren aan de pas.
• Rab is verantwoordelijk voor tethering, docking en het reguleren van de fusie door SNARE
eiwitten.
• Rab eiwitten markeren ook de identiteit van de membraan. Elk membraan heeft een eigen rab
eiwit. Rab5 is bijvoorbeeld belangrijk voor endosomen.
• Een rab5-GEF aan de endosomale membraan helpt dan om de membraan te binden. Rab5 kan
een kinase aantrekken (PI3K) die PI(3)P kan maken. Die zorgt ervoor dat er meer Rab5- GEF
wordt gerekruteerd en dus Rab5. Dus de GEF en de Pi3-kinase helpen elkaar door Rab5 dus is het
een vorm van positieve feedback. Er is dan een domein in het membraan met veel Rab5 en
Pi(3)P. Hier kunnen tethering eiwitten bij gehaald worden.
→ Wanneer een Rab geactiveerd is, wordt er een GEF geactiveerd die weer een andere Rab activeert
die de GEF van de ander activeert. Dit is een ander type van regulatie: de Rab cascade. = positieve
feedback
• De GEF van Rab7 (late endosoom) is een effector van Rab5 (early
endosoom). De GAP van Rab5 is op zijn buurt weer een effector van
Rab7. Hierdoor zal Rab5 juist weer inactief worden (= negatieve
feedback)
• De ene Rab wordt dus vervangen door het andere door kruisregulering
van GEF’s en GAP’s: organelle maturation
Samenvatting: Vesicle targetten
• Verschillende vesicles - verschillende Rabs
• Gebruik van Rab GEF's voor Rab-versterking of -schakeling
• Rab-effectoren voor motiliteit, tethering of docking/fusie
Vescile fusie
• Het echte fuseren gebeurt met behulp van
SNARE’s: coiled coil eiwitbundels
• SNARE’s brengen membranen naar elkaar
toe, zodat de energetische barrière voor
lipiden om over te springen overwonnen
wordt en de membranen fuseren.
• Kan geregeld worden door Rabs
• SNARE disassemblage vereist energie (ATP hydrolyse door NSF)
o NSF (ATPase) demonteert en reactiveert SNARE's
• Een SNARE-complex bestaat uit twee delen:
o v-SNARE: is aanwezig op de vesicle
o t-SNARE: is aanwezig op het targetmembraan
• SNAREs vinden elkaar en vormen dan spontaan een bundeltje -> energie komt vrij ->
vrijgekomen energie wordt gebruikt om membranen dicht bij elkaar te brengen ->
VESCULAIR TRANSPORT (H13)
• Membranen katalyseren chemische reacties door
bepaalde componenten te concentreren.
• Membraansystemen houden contact d.m.v.
vesiculair transport. Hierdoor worden membraan
componenten uitgewisseld zonder dat de identiteit
van het compartiment verloren gaat.
• Secretoire route: membraancompartiment die met
elkaar verbonden zijn via vesiculair transport (ER, golgi,
plasmamembraan, endosomen en lysosomen).
• Transport kan niet één kant op gaan, want dan zal een
membraancompartiment verloren gaan. Retrieval is een
vorm van transport terug naar het ER, zodat lipiden en
eiwitten worden aangevuld.
• In het rood staat uitwisseling via exocytose, in het groen
via endocytose en in het blauw via retrieval weergegeven
Maken van een vesicle
• Het is energetisch gunstig voor een membraan
om plat te zijn; dus het kost energie om een
vesicle te vormen.
• M.b.v. coat-eiwitten krijgt het membraan een
kromming en wordt het juiste molecuul
geconcentreerd in de vesicle. Deze eiwitten
binden aan de cytoplasmatische kant van het
membraan.
• Functies van coat:
o Selecteert cargomoleculen
o Buigt het membraan
Types coated vesicles
• COPI: tussen de verschillende golgi cisternae
• COPII: van het ER naar het golgi
• Clathrine: om endosomen te maken of om bepaalde
vesicles vanuit het golgi te transporteren naar het endo- en
lysosoom
o Clathrin coat heeft 2 lagen:
- Adapter eiwitten: selectie van cargo receptoren:
receptoren die transmembraan moleculen kunnen
vangen en concentreren.
- Membraan curvatuur: clathrin triskelions, deze
vormen een soort mandje waardoor de vesicle stabieler is
Hoe monteer je een coat op een specifieke plaats?
• Om een vesicle te maken zijn de fosfatidylinosotol lipiden van belang (glycerol, alcohol met 3 OH
groepen, en een fosfaat)
• De inosotol kan gefosforyleerd worden op verschillende plekken waardoor er verschillende typen
fosfatidylinostol ontstaan
, o PIP4: fosfaat op de 4e plek gezet
• Er zijn eiwitten in de cel die speciaal aan deze kopgroepen binden afhankelijk van welke
fosfaatgroepen op welke plekken zitten.
• Er zijn specifieke kinase en fosfatases die het specifiek fosforyleren.
• Elk membraan compartiment in de cel heeft verrijking in speciale vorm van fosfoinosotiden.
• Een clatherin adaptor eiwit (AP2) is gevoelig voor twee dingen; de specifieke lipiden (PI(4,5)P2)
en de cargo receptoren; het is een coincidence receptor. Als het beide kan binden wordt het
actief en gaat het open als het ware.
• De vorming van de vesicles berust vaak op kleine GTPases:
In het geval van COPII vesicles is hun eerste laag G-adaptine en
een kleine GTP-ase (Sar1). Deze bindt alleen in de GTP gebonden
vorm aan de membraan (na GEF activatie dus). Sar1-GEF is dan
membraangebonden (door amfipatische helix) en kan Sar-1GDP
omzetten naar Sar1-GTP die ook in de membraan zit. Die kan
COPII herkennen. Na de binding zijn de eiwitten Sec23/Sec24
aanwezig die de eerste laag maken door te binden met de
cargoreceptor. De membraan moet dan gebogen worden, dit
gebeurt vaak door coiled coils die binden en dan duwen. Dan moet de
tweede laag gevormd worden. In het geval van clatherine is het een soort
rieten mand. Het zijn clathrin triskelions die de vesiculaire structuur maken.
Deze triskelions hebben symmetrie en polymeriseren in de mand achtige
structuur.
• Voor de COPII vesicles zijn de Sec13/Sec31 belangrijk voor het maken van
de tweede laag. Ook deze maken een soort rieten mand structuur om
de membraan te buigen. Dit proces gaat beter wanneer de membraan
al gebogen wordt, hier helpen de BAR eiwitten bij.
o BAR domein kan goed binden aan het membraan en heeft een
gebogen structuur -> kan membraan gebogen maken
• Samen met de eerste laag van de coat wordt de curvatuur van de
membraan bewerkstelligt.
• Niet alle soorten stoffen kunnen in een vesicle zoals bijvoorbeeld
collageenfibrillen. Deze worden in de vorm van procollageen gemaakt
en dan moet het coating proces aangepast worden. Daarvoor zijn
specifieke packaging proteins die aangepast worden door bv. ubiquitine.
Er wordt dan een hele lange structuur gevormd.
,Afsnoeren van het vesicle
• In het geval van clathrine is er een specifieke GTPase, dynamine, die een spiraal om de
nek van de vesicle maakt.
• Het membraan wordt dat dicht bij elkaar gebracht en lipide worden gemodificeerd en
het vesicle wordt afgesnoerd mbv hydrolyse (energie gebruikt om af te snoeren).
• Dus Dynamin en geassocieerde eiwitten:
o Vervorming van het membraan
o Lipide modificaties
Vesicle uncoating
Als het vesicle bij de bestemming is, moet de coat eraf. Het is daarom heel erg
belangrijk dat het maken van de coat een reversibel proces is.
1. Hydrolyse van PI(4,5)P2 door een specifiek fosfatase (AP2-binding is
verzwakt)
2. GTP-hydrolyse door GTPase voor coat werving
3. Membraan curvatuur kan een GAP activeren voor coat recruitment GTPase
ARF
4. Uncoating ATPase (hsp70 chaperon): gepolymeriseerde eiwitten (tweede
laag) worden weggehaald door chaperonne eiwitten.
Samenvatting: Vesicle maken
• Cargoselectie en coat assemblage
o Cargo receptoren
o Lipidensamenstelling
o Coat rekrutering GTPasen
o Membraanbuigende eiwitten (bv. Coat)
o Verpakkingseiwitten, coat modificaties
• Afsnoeren (pinching off) van het vesicle
o GTPase dynamin
o Lipidenmodificaties
• Ontmantelen van het vesicle
o Lipidensamenstelling, kromming/curvatuur
o GTPase activiteit
o ATPase (chaperon)
o Coat fosforylering
Een vesicle targetten naar de juiste locatie
• Ook bij het targeten spelen GTPases een belangrijke rol bij, dit zijn
de Rab-GTPases
• Het principe is hetzelfde; inactief in de GDP gebonden
vorm en actief in de GTP gebonden vorm door GAP en
GEF.
• De actieve Rab-GTP (in de membraan) kan dan binden
aan motor-eiwitten of aan eiwitten die fusie
bevorderen.
• Het vesicle is gemaakt en dan wordt het Rab eiwit
gerekruteerd wat kan zorgen voor transport of
tethering.
• Aan de target membraan zijn lange eiwitten die als een
soort armpjes zwaaien die het vesicle kunnen vangen.
, Als het gevangen is wordt het dicht in de buurt van de membraan gebracht, docking. Dan komen
de eiwitten die fusie reguleren aan de pas.
• Rab is verantwoordelijk voor tethering, docking en het reguleren van de fusie door SNARE
eiwitten.
• Rab eiwitten markeren ook de identiteit van de membraan. Elk membraan heeft een eigen rab
eiwit. Rab5 is bijvoorbeeld belangrijk voor endosomen.
• Een rab5-GEF aan de endosomale membraan helpt dan om de membraan te binden. Rab5 kan
een kinase aantrekken (PI3K) die PI(3)P kan maken. Die zorgt ervoor dat er meer Rab5- GEF
wordt gerekruteerd en dus Rab5. Dus de GEF en de Pi3-kinase helpen elkaar door Rab5 dus is het
een vorm van positieve feedback. Er is dan een domein in het membraan met veel Rab5 en
Pi(3)P. Hier kunnen tethering eiwitten bij gehaald worden.
→ Wanneer een Rab geactiveerd is, wordt er een GEF geactiveerd die weer een andere Rab activeert
die de GEF van de ander activeert. Dit is een ander type van regulatie: de Rab cascade. = positieve
feedback
• De GEF van Rab7 (late endosoom) is een effector van Rab5 (early
endosoom). De GAP van Rab5 is op zijn buurt weer een effector van
Rab7. Hierdoor zal Rab5 juist weer inactief worden (= negatieve
feedback)
• De ene Rab wordt dus vervangen door het andere door kruisregulering
van GEF’s en GAP’s: organelle maturation
Samenvatting: Vesicle targetten
• Verschillende vesicles - verschillende Rabs
• Gebruik van Rab GEF's voor Rab-versterking of -schakeling
• Rab-effectoren voor motiliteit, tethering of docking/fusie
Vescile fusie
• Het echte fuseren gebeurt met behulp van
SNARE’s: coiled coil eiwitbundels
• SNARE’s brengen membranen naar elkaar
toe, zodat de energetische barrière voor
lipiden om over te springen overwonnen
wordt en de membranen fuseren.
• Kan geregeld worden door Rabs
• SNARE disassemblage vereist energie (ATP hydrolyse door NSF)
o NSF (ATPase) demonteert en reactiveert SNARE's
• Een SNARE-complex bestaat uit twee delen:
o v-SNARE: is aanwezig op de vesicle
o t-SNARE: is aanwezig op het targetmembraan
• SNAREs vinden elkaar en vormen dan spontaan een bundeltje -> energie komt vrij ->
vrijgekomen energie wordt gebruikt om membranen dicht bij elkaar te brengen ->
