Les 1 Algemene DNA technieken
Restrictee ncleases
Bijedeerecombi a teeDNAetech ologieeworde edee atnnrlijkeee zymatschee rocesse e
agebootstei ehetelabeome ienwee( iet- atnnrlijke)ecombi atese a eDNAeteecreëre .
Hier ooreworde ee zyme egebrnikt,ee zyme eworde egebrnikteomdatezeezorge e ooreee e
oors elbare,es ecifekeeacteedieeookemakkelijkere erkrijgbaarezij .
Ereworde e erschille deee zyme e oore erschille dee rocesse egebrnikt.
K i e e->e nclease
Bewerke e->eei d-modifcere deee zyme
Plakke e->eLigase
Ko iëre e->eDNAe olymerase
Restrictee nclease eworde egezni erdenit
bacterië .eDeefn ctee a edezeee zyme ei
bacterië eiseheteo schadelijkemake e a
iraaleDNA.eAlleebacteriestamme ehebbe
n iekeerestricteee zyme ,eerezij emeereda
3000e erschille deebeke dewaar a e600
commercieele erkrijgbaarezij .
Deegrotee erschille etnsse e ncelase ezij
deeexo nclease,edieek i te a nitehet
nitei dee a edeestre gee edeee do nclease,
dieek i tei ehetemidde e a edeestre g.
Naasteexo-ee ee do ncleasesebestaa eereook;eDNAee eRNAe ncleases,ess/dse ncleases,e
s ecifekeee eas ecifekee ncleases.
Ty eeIIerestricteee zyme ezij ezoes ecifekedatejeewa eeredeeDNAeseqne teebeke deiseexacte
kn te oors elle ewaarehetee zymegaatek i e .
Elkerestricteee zymeiseee en iekeecombi atee a eee eherke i gsseqne teee edeema iere
a ek i e .eOmdatedeemeesteerestricte-e zyme ewerke ealseee ehomodimeer,ehierdoore
erto e eherke i gssiteebij aealtjdeee eomgekeerdeesymmetrieeofwele ali droom.eDiteisetee
herke e eo e1estre gewa eere a nitehetemidde edeeseqne teecom leme taireli kseise
t.o. .e a erechts.
Ee erestricteee zymek i te aakebi e edeeherke i gsseqne te,emaaresommigeek i e e
hierebnite .eDaar aastekn e edeee zyme eo etweeema ierek i e ,estckyeofebln t.
Ee e oorbeelde a eee ebln tek i :
+
,Ee e oorbeelde a eee e5’e(bo e )ee eee e3’e(o der)estckyek i :
Isoschizomere ezij e erschille deee zyme emetedezelfdeeherke i gsseqne teee edezelfdee
ma iere a ek i e ,editewordtegebrniktewa eereéé e a ebeideegeschiktereise ooredee
gekoze ereacteco ditese(bnfersame stelli g).
Neo-isoschizomere ezij e erschille deee zyme edieedezelfdeeherke i gsseqne teehebbe e
maareee e erschille deema iere a ek i e .
Ligase
Fragme te emetedezelfdeeo erha gekn e emeteelkaare erbo de eworde ,ehierewordteooke
gebrnike a egemaaktetjde sedeerecombi a teeDNAetech ologie.eHierbijezorgteeersteee e
restricteee zyme oorehetek i e e a edeesniker-fosfaatebackbo es,edaar aewordteee eDNAe
fragme te a eee ea deremolecnnletoege oegd.eAlselaatsteezorgteligasee ooredeeslnit ge a ede
stre ge .
Ligaseeherstelte ormaalei eDNAefosfodiesterebi di gewa eeredezeebreektetjde edeere licatee
e /ofedeere arate,ei e i oewordtedeeligateeo erehetealgemee ebijee kelstre gsegedaa .
I e itroewordtedite roceseo erehetealgemee ebijednbbelstre gseDNAegedaa .
Deenitei de e a efragme te emoetetoe alligebotse e oordateligaseeka ewerke .eLigaseewerkte
ookemi dereefcië tebijebln teei de eomdatedeefragme te e ieteo derli gewaterstofrngge e
aa gaa .eBijestckyenitei de etreedtea eali geo eofweledee ormi ge a ewaterstofebrngge e
tnsse e erschille deefragme te ,ehierdooreheefeligaseemeeretjdeometeebi de ewatezorgte
ooreee ehogereeka seo esncces.
Ki aseee eFosfatase
Ki aseeiseee e erzamel aame ooreee egroe ee zyme edieeee efosfaatgroe eka eaa bre ge e
o eee ea dereeeiwiteofemolecnnl.
Fosfataseeiseee ee zymedatefosfaatgroe e e a e erschille deemolecnle eka e erwijdere .
, Oefening
Be aaledeeo erha g.e5’/3’/bln t,ee ekn e edeenitei de emeteelkaar?
Hierbijegeldte->e5’eallee emete5’e3’eallee emete3’ebln teallee emetebln t
Voorbeeld:
1.eG/GATCCee e2.eTC/GATCGA?eBeidee5’
Bo e stee5’->e3’eo derstee3’e->e5’,ealtjdegeschre e e a e5’->3’
1.e5’eGe–e3’eeeeeeeeeeee2.e5’eTCe–e3’eee
eeee3’eCCTAGe5’eeeeeeeeee3’eAGCTAGe5’
Combi ate:e1+2=e5’eGGATCGAeeee2+1=e5’eTCGATCC
eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee3’eCCTAGCTeeeeeeeeeeeeeee3’eAGCTAGG
DNAeisolate
DNAeka e erme ig nldigde(am lifcate)eworde edoorebacterië ,ePCReofesy thesee a eDNA.e
Bijedeeam lifcateedoorebacterië ,ewordteee e lasmideDNAegebrniktealseklo eer ector.e
(Vector=drager)ePlasmideiseee eklei ecircnlairebacterieeleDNAedateo afa kelijkeise a ehete
chromosomaleeDNA.
Deegehelee rocednree a edeeklo eri gebegi tebijehetei bonwe e a ei serte(DNA)ei eee e
ectored.m. .erecombi a teDNAetech ologie,edaar aewordteee egastheercelegetra sformeerd
meteee e ector.eDezeegastheercelegaatedele ee eookedeei sertebe ate dee ectorere licere .e
Deelaatsteesta eisedeeisolatee a e lasmide e(mi i re ).
PlasmideDNAewordtegezni erded.m. .efe oleextracte:
-eDeebacteriëleecelwa dewordte erzwaktemetelysozymee eEDTA.
-eDaar aeworde edeecelle egelyseerdemeteSDSee eNaOHe( He12).eNaOHezorgte oorehete
erzachte e a edeecelwa dee edatehetedsDNAessDNAewordteookewel:ede atnrate.eNaasteDNAe
zorgteheteooke ooredeede atnratee a edeemeesteeeiwite ewatehel tebijehetelateres litse e a e
lasmideeeiwite .
-eHetelysaatewordtedaar aege entraliseerdemetekalinmacetaat.eHiereka edeessDNAeternge aare
dsDNA,editeisesim ele ooredeeklei ee lasmideemaareo mogelijke oorehetegDNAedite ormteda e
ee e ro editemakkelijkegescheide eka eworde e a ehete lasmideeDNAedoorece trifngere .
-eFe oleextracte
-eEtha ole reci atee(zorgteer ooredatezonte ei teracteseaa ekn e egaa emete egatefe
gelade efosfaatewaardoorehete olariteite erliestee edaardooredeeo losbaarheidei ewater.
BijeRNAeisolateeisebela grijkedateRNAezeerei stabieleisee eRNaseejnistezeerestabiel.
Daaromemoetegeleteworde eo :
-eO middellijke aeisolatee(orgaa eb )es a efreezee a esam lesei e loeibareestkstof.
-eTRIZOLe(i itroge )estabiliseerteRNAetjde sehomoge isate.
-eDEPCeaa eo lossi ge etoe oege eomeRNaseeteei act ere .
-eHomoge isere /lysere ei eaa wezigheide a eRNaseeremmers.
-eO slaa ei e–e80e°Cebijeetha ol.
Restrictee ncleases
Bijedeerecombi a teeDNAetech ologieeworde edee atnnrlijkeee zymatschee rocesse e
agebootstei ehetelabeome ienwee( iet- atnnrlijke)ecombi atese a eDNAeteecreëre .
Hier ooreworde ee zyme egebrnikt,ee zyme eworde egebrnikteomdatezeezorge e ooreee e
oors elbare,es ecifekeeacteedieeookemakkelijkere erkrijgbaarezij .
Ereworde e erschille deee zyme e oore erschille dee rocesse egebrnikt.
K i e e->e nclease
Bewerke e->eei d-modifcere deee zyme
Plakke e->eLigase
Ko iëre e->eDNAe olymerase
Restrictee nclease eworde egezni erdenit
bacterië .eDeefn ctee a edezeee zyme ei
bacterië eiseheteo schadelijkemake e a
iraaleDNA.eAlleebacteriestamme ehebbe
n iekeerestricteee zyme ,eerezij emeereda
3000e erschille deebeke dewaar a e600
commercieele erkrijgbaarezij .
Deegrotee erschille etnsse e ncelase ezij
deeexo nclease,edieek i te a nitehet
nitei dee a edeestre gee edeee do nclease,
dieek i tei ehetemidde e a edeestre g.
Naasteexo-ee ee do ncleasesebestaa eereook;eDNAee eRNAe ncleases,ess/dse ncleases,e
s ecifekeee eas ecifekee ncleases.
Ty eeIIerestricteee zyme ezij ezoes ecifekedatejeewa eeredeeDNAeseqne teebeke deiseexacte
kn te oors elle ewaarehetee zymegaatek i e .
Elkerestricteee zymeiseee en iekeecombi atee a eee eherke i gsseqne teee edeema iere
a ek i e .eOmdatedeemeesteerestricte-e zyme ewerke ealseee ehomodimeer,ehierdoore
erto e eherke i gssiteebij aealtjdeee eomgekeerdeesymmetrieeofwele ali droom.eDiteisetee
herke e eo e1estre gewa eere a nitehetemidde edeeseqne teecom leme taireli kseise
t.o. .e a erechts.
Ee erestricteee zymek i te aakebi e edeeherke i gsseqne te,emaaresommigeek i e e
hierebnite .eDaar aastekn e edeee zyme eo etweeema ierek i e ,estckyeofebln t.
Ee e oorbeelde a eee ebln tek i :
+
,Ee e oorbeelde a eee e5’e(bo e )ee eee e3’e(o der)estckyek i :
Isoschizomere ezij e erschille deee zyme emetedezelfdeeherke i gsseqne teee edezelfdee
ma iere a ek i e ,editewordtegebrniktewa eereéé e a ebeideegeschiktereise ooredee
gekoze ereacteco ditese(bnfersame stelli g).
Neo-isoschizomere ezij e erschille deee zyme edieedezelfdeeherke i gsseqne teehebbe e
maareee e erschille deema iere a ek i e .
Ligase
Fragme te emetedezelfdeeo erha gekn e emeteelkaare erbo de eworde ,ehierewordteooke
gebrnike a egemaaktetjde sedeerecombi a teeDNAetech ologie.eHierbijezorgteeersteee e
restricteee zyme oorehetek i e e a edeesniker-fosfaatebackbo es,edaar aewordteee eDNAe
fragme te a eee ea deremolecnnletoege oegd.eAlselaatsteezorgteligasee ooredeeslnit ge a ede
stre ge .
Ligaseeherstelte ormaalei eDNAefosfodiesterebi di gewa eeredezeebreektetjde edeere licatee
e /ofedeere arate,ei e i oewordtedeeligateeo erehetealgemee ebijee kelstre gsegedaa .
I e itroewordtedite roceseo erehetealgemee ebijednbbelstre gseDNAegedaa .
Deenitei de e a efragme te emoetetoe alligebotse e oordateligaseeka ewerke .eLigaseewerkte
ookemi dereefcië tebijebln teei de eomdatedeefragme te e ieteo derli gewaterstofrngge e
aa gaa .eBijestckyenitei de etreedtea eali geo eofweledee ormi ge a ewaterstofebrngge e
tnsse e erschille deefragme te ,ehierdooreheefeligaseemeeretjdeometeebi de ewatezorgte
ooreee ehogereeka seo esncces.
Ki aseee eFosfatase
Ki aseeiseee e erzamel aame ooreee egroe ee zyme edieeee efosfaatgroe eka eaa bre ge e
o eee ea dereeeiwiteofemolecnnl.
Fosfataseeiseee ee zymedatefosfaatgroe e e a e erschille deemolecnle eka e erwijdere .
, Oefening
Be aaledeeo erha g.e5’/3’/bln t,ee ekn e edeenitei de emeteelkaar?
Hierbijegeldte->e5’eallee emete5’e3’eallee emete3’ebln teallee emetebln t
Voorbeeld:
1.eG/GATCCee e2.eTC/GATCGA?eBeidee5’
Bo e stee5’->e3’eo derstee3’e->e5’,ealtjdegeschre e e a e5’->3’
1.e5’eGe–e3’eeeeeeeeeeee2.e5’eTCe–e3’eee
eeee3’eCCTAGe5’eeeeeeeeee3’eAGCTAGe5’
Combi ate:e1+2=e5’eGGATCGAeeee2+1=e5’eTCGATCC
eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee3’eCCTAGCTeeeeeeeeeeeeeee3’eAGCTAGG
DNAeisolate
DNAeka e erme ig nldigde(am lifcate)eworde edoorebacterië ,ePCReofesy thesee a eDNA.e
Bijedeeam lifcateedoorebacterië ,ewordteee e lasmideDNAegebrniktealseklo eer ector.e
(Vector=drager)ePlasmideiseee eklei ecircnlairebacterieeleDNAedateo afa kelijkeise a ehete
chromosomaleeDNA.
Deegehelee rocednree a edeeklo eri gebegi tebijehetei bonwe e a ei serte(DNA)ei eee e
ectored.m. .erecombi a teDNAetech ologie,edaar aewordteee egastheercelegetra sformeerd
meteee e ector.eDezeegastheercelegaatedele ee eookedeei sertebe ate dee ectorere licere .e
Deelaatsteesta eisedeeisolatee a e lasmide e(mi i re ).
PlasmideDNAewordtegezni erded.m. .efe oleextracte:
-eDeebacteriëleecelwa dewordte erzwaktemetelysozymee eEDTA.
-eDaar aeworde edeecelle egelyseerdemeteSDSee eNaOHe( He12).eNaOHezorgte oorehete
erzachte e a edeecelwa dee edatehetedsDNAessDNAewordteookewel:ede atnrate.eNaasteDNAe
zorgteheteooke ooredeede atnratee a edeemeesteeeiwite ewatehel tebijehetelateres litse e a e
lasmideeeiwite .
-eHetelysaatewordtedaar aege entraliseerdemetekalinmacetaat.eHiereka edeessDNAeternge aare
dsDNA,editeisesim ele ooredeeklei ee lasmideemaareo mogelijke oorehetegDNAedite ormteda e
ee e ro editemakkelijkegescheide eka eworde e a ehete lasmideeDNAedoorece trifngere .
-eFe oleextracte
-eEtha ole reci atee(zorgteer ooredatezonte ei teracteseaa ekn e egaa emete egatefe
gelade efosfaatewaardoorehete olariteite erliestee edaardooredeeo losbaarheidei ewater.
BijeRNAeisolateeisebela grijkedateRNAezeerei stabieleisee eRNaseejnistezeerestabiel.
Daaromemoetegeleteworde eo :
-eO middellijke aeisolatee(orgaa eb )es a efreezee a esam lesei e loeibareestkstof.
-eTRIZOLe(i itroge )estabiliseerteRNAetjde sehomoge isate.
-eDEPCeaa eo lossi ge etoe oege eomeRNaseeteei act ere .
-eHomoge isere /lysere ei eaa wezigheide a eRNaseeremmers.
-eO slaa ei e–e80e°Cebijeetha ol.
