Moleculaire en biochemische technieken
Aantekeningen les week 1
PCR = Polymerase Chain Reaction. We voeren een PCR uit om DNA te vermeerderen,
specifiek een stukje gen waarin je geïnteresseerd bent. Je werkt met een mastermix; je hebt
nodig primers, MgCl2, buffer, dNTP’s, mQ, DNA template, DNA polymerase. De primers zijn
nodig om aan het DNA te binden (begin replicatie). De functie van de primers is het
aangeven vanaf waar het DNA verdubbeld moet worden. De polymerase die start de
kettingreactie (enzym die zorgt dat de reactie plaats gaat vinden). MgCl2 is de co-factor voor
polymerase (zonder MgCl2 werkt DNA polymerase niet). dNTP’s zijn de losse nucleotiden.
mQ is nodig om de juiste concentratie te verkrijgen.
5’ ------------------- 3’
3’ ------------------- 5’
We hebben te maken met twee primers; forward en reverse. De primer bindt andersom,
polymerase voegt aan de 3’ kant nucleotiden toe. De forward primer bindt dus aan de
onderste streng, anders zou hij de verkeerde kant oplopen en een verkeerd stuk DNA
kopiëren. De reverse primer werkt aan de bovenste (gaat terug).
We gaan genen klonen omdat we meerdere kopiëren van genen nodig hebben om
onderzoek te doen. We kunnen een bacterie en gen van interesse tot expressie laten
brengen. Het eiwit kunnen we isoleren (uit bacterie halen) en onderzoek mee doen. Je kan
ook DNA isoleren uit de bacterie en daar onderzoek mee doen.
Basisprincipe kloneren. We beginnen met een DNA fragment (is DNA stukje waarin je
interesse hebt). Dit DNA wordt geplakt in een DNA vector (plasmide) = circulair molecuul,
dan heet het een recombinant DNA molecuul. Vervolgens plasmide in bacterie brengen
(hostcel = gastheer). In zo een bacterie gaat zo een stukje DNA zich vanzelf vermeerderen.
Ook de bacterie gaat zich delen, je krijgt dus heel veel bacterie met dat gen van interesse in
je flesje. Nadat je heel veel rondes van vermenigvuldiging hebt gehad, heb je veel bacteriën
met gen van interesse, dan krijg je veel kolonies met dezelfde DNA samenstelling erin. Dan
wordt er gezegd dat het gen gekloneerd is. Dus één kloon op een plaat bevat identiek
dezelfde cellen.
Allereerst moeten we zorgen dat we het DNA van interesse in handen krijgen en vervolgens
hebben we de bacterie nodig. We hebben een humane cel en dan doe je DNA isolatie. Het
doel is dus om je gen van interesse in handen te krijgen (kan door middel van PCR).
Bacterie met plasmide, je doet plasmide isolatie. Dan restrictie en plak je gen van interesse
in plasmide. Je krijgt dus DNA van twee kanten. Je bent met twee cellen, humane cel met
DNA en bacterie cel met plasmide. Deze twee cellen breng je dus terug naar één cel.
PCR. Polymerasekettingsreactie. Taq DNA polymerase is gevonden in hotspring in Amerika
(is dus een enzym wat heel goed tegen hoge temperaturen kan). Vervolgens helemaal
gemodificeerd om hem in het lab te kunnen gebruiken. Stappen in PCR. We beginnen met
dubbele streng DNA.
Stap 1. Denaturatie bij ongeveer 95 graden. Bij de denaturatie komen de strengen los van
elkaar. Er worden dus twee losse strengen verkregen. De verbindingen worden verbroken
door de hitte. Let op 5’ en 3’ dat ze aan de juiste kant staan.
Stap 2. Annealing. Tijdens deze fase binden de primers. De temperatuur is afhankelijk van
welke primer je gebruikt. De temperatuur ligt meestal rond de 55 graden. De temperatuur
wordt verlaagd in vergelijking met de denaturatie omdat de primers dan kunnen binden.
Forward primer bindt aan de onderste streng en reverse primer aan bovenste streng.
Stap 3. Elongatie. Gebeurt bij een temperatuur van 72 graden omdat dat de juiste
temperatuur is voor Taq polymerase. Tijdens de elongatie gaan de nieuwe nucleotiden
binden, de Taq polymerase gaat zijn werk dus doen. Taq polymerase zal binden en zal
nucleotiden gaan toevoegen tot er weer een dubbelstrengs DNA molecuul ontstaat. Nu
hebben we één cyclus gehad, dan heb je 4 kopieën. De kopieën nemen exponentieel toe. Na
,de elongatie gaan we terug naar de eerste stap, de denaturatie, voor de volgende cyclus.
De forward primer bindt altijd aan de onderste streng omdat DNA polymerase maar één kant
op kan lopen. De primer zal altijd complementair zijn aan de streng (andersom dus). De
reverse primer bindt aan de coderende streng. Primer schrijf je altijd op van 5’ naar 3’.
* Forward primer, deze primer wordt precies hetzelfde als de bovenste streng. Hij bindt aan
de onderste streng.
* Reverse primer, die is complementair aan de bovenste streng. Hij is dan hetzelfde als de
onderste streng, maar je schrijft hem op van 5’ naar 3’. Dus daar even op letten.
Het aantal cyclussen ligt aan hoeveel DNA je nodig hebt. De temperaturen zijn heel
belangrijk. Eerst heel erg verhitten om DNA enkelstrengs te maken, daarna temperatuur
verlagen om primers te hechten, daarna temperatuur weer iets verhoogd voor Taq
polymerase.
We beginnen met template DNA. De primer hecht en DNA polymerase blijft oneindig
doorlopen over je DNA. Het duurt een aantal ronden voordat je echt je gen van interesse
gaat hebben. Daarom belangrijk dat je meerdere cyclussen hebt. Aan het einde van eerste
ronde PCR loopt hij oneindig door, als hij dan weer gaat lopen dan bindt ook de reverse
primers en krijg je pas je DNA van interesse.
, Primers ontwerpen regels. Als eerst is het van belang op welke plek de primers liggen. De 3’
kanten van de F en R primers moeten naar elkaar wijzen. De ideale primer bestaat uit 20 –
24 nucleotiden voor een hoge specificiteit. Het C/G percentage mag niet te hoog zijn, de
Aantekeningen les week 1
PCR = Polymerase Chain Reaction. We voeren een PCR uit om DNA te vermeerderen,
specifiek een stukje gen waarin je geïnteresseerd bent. Je werkt met een mastermix; je hebt
nodig primers, MgCl2, buffer, dNTP’s, mQ, DNA template, DNA polymerase. De primers zijn
nodig om aan het DNA te binden (begin replicatie). De functie van de primers is het
aangeven vanaf waar het DNA verdubbeld moet worden. De polymerase die start de
kettingreactie (enzym die zorgt dat de reactie plaats gaat vinden). MgCl2 is de co-factor voor
polymerase (zonder MgCl2 werkt DNA polymerase niet). dNTP’s zijn de losse nucleotiden.
mQ is nodig om de juiste concentratie te verkrijgen.
5’ ------------------- 3’
3’ ------------------- 5’
We hebben te maken met twee primers; forward en reverse. De primer bindt andersom,
polymerase voegt aan de 3’ kant nucleotiden toe. De forward primer bindt dus aan de
onderste streng, anders zou hij de verkeerde kant oplopen en een verkeerd stuk DNA
kopiëren. De reverse primer werkt aan de bovenste (gaat terug).
We gaan genen klonen omdat we meerdere kopiëren van genen nodig hebben om
onderzoek te doen. We kunnen een bacterie en gen van interesse tot expressie laten
brengen. Het eiwit kunnen we isoleren (uit bacterie halen) en onderzoek mee doen. Je kan
ook DNA isoleren uit de bacterie en daar onderzoek mee doen.
Basisprincipe kloneren. We beginnen met een DNA fragment (is DNA stukje waarin je
interesse hebt). Dit DNA wordt geplakt in een DNA vector (plasmide) = circulair molecuul,
dan heet het een recombinant DNA molecuul. Vervolgens plasmide in bacterie brengen
(hostcel = gastheer). In zo een bacterie gaat zo een stukje DNA zich vanzelf vermeerderen.
Ook de bacterie gaat zich delen, je krijgt dus heel veel bacterie met dat gen van interesse in
je flesje. Nadat je heel veel rondes van vermenigvuldiging hebt gehad, heb je veel bacteriën
met gen van interesse, dan krijg je veel kolonies met dezelfde DNA samenstelling erin. Dan
wordt er gezegd dat het gen gekloneerd is. Dus één kloon op een plaat bevat identiek
dezelfde cellen.
Allereerst moeten we zorgen dat we het DNA van interesse in handen krijgen en vervolgens
hebben we de bacterie nodig. We hebben een humane cel en dan doe je DNA isolatie. Het
doel is dus om je gen van interesse in handen te krijgen (kan door middel van PCR).
Bacterie met plasmide, je doet plasmide isolatie. Dan restrictie en plak je gen van interesse
in plasmide. Je krijgt dus DNA van twee kanten. Je bent met twee cellen, humane cel met
DNA en bacterie cel met plasmide. Deze twee cellen breng je dus terug naar één cel.
PCR. Polymerasekettingsreactie. Taq DNA polymerase is gevonden in hotspring in Amerika
(is dus een enzym wat heel goed tegen hoge temperaturen kan). Vervolgens helemaal
gemodificeerd om hem in het lab te kunnen gebruiken. Stappen in PCR. We beginnen met
dubbele streng DNA.
Stap 1. Denaturatie bij ongeveer 95 graden. Bij de denaturatie komen de strengen los van
elkaar. Er worden dus twee losse strengen verkregen. De verbindingen worden verbroken
door de hitte. Let op 5’ en 3’ dat ze aan de juiste kant staan.
Stap 2. Annealing. Tijdens deze fase binden de primers. De temperatuur is afhankelijk van
welke primer je gebruikt. De temperatuur ligt meestal rond de 55 graden. De temperatuur
wordt verlaagd in vergelijking met de denaturatie omdat de primers dan kunnen binden.
Forward primer bindt aan de onderste streng en reverse primer aan bovenste streng.
Stap 3. Elongatie. Gebeurt bij een temperatuur van 72 graden omdat dat de juiste
temperatuur is voor Taq polymerase. Tijdens de elongatie gaan de nieuwe nucleotiden
binden, de Taq polymerase gaat zijn werk dus doen. Taq polymerase zal binden en zal
nucleotiden gaan toevoegen tot er weer een dubbelstrengs DNA molecuul ontstaat. Nu
hebben we één cyclus gehad, dan heb je 4 kopieën. De kopieën nemen exponentieel toe. Na
,de elongatie gaan we terug naar de eerste stap, de denaturatie, voor de volgende cyclus.
De forward primer bindt altijd aan de onderste streng omdat DNA polymerase maar één kant
op kan lopen. De primer zal altijd complementair zijn aan de streng (andersom dus). De
reverse primer bindt aan de coderende streng. Primer schrijf je altijd op van 5’ naar 3’.
* Forward primer, deze primer wordt precies hetzelfde als de bovenste streng. Hij bindt aan
de onderste streng.
* Reverse primer, die is complementair aan de bovenste streng. Hij is dan hetzelfde als de
onderste streng, maar je schrijft hem op van 5’ naar 3’. Dus daar even op letten.
Het aantal cyclussen ligt aan hoeveel DNA je nodig hebt. De temperaturen zijn heel
belangrijk. Eerst heel erg verhitten om DNA enkelstrengs te maken, daarna temperatuur
verlagen om primers te hechten, daarna temperatuur weer iets verhoogd voor Taq
polymerase.
We beginnen met template DNA. De primer hecht en DNA polymerase blijft oneindig
doorlopen over je DNA. Het duurt een aantal ronden voordat je echt je gen van interesse
gaat hebben. Daarom belangrijk dat je meerdere cyclussen hebt. Aan het einde van eerste
ronde PCR loopt hij oneindig door, als hij dan weer gaat lopen dan bindt ook de reverse
primers en krijg je pas je DNA van interesse.
, Primers ontwerpen regels. Als eerst is het van belang op welke plek de primers liggen. De 3’
kanten van de F en R primers moeten naar elkaar wijzen. De ideale primer bestaat uit 20 –
24 nucleotiden voor een hoge specificiteit. Het C/G percentage mag niet te hoog zijn, de
