B05MBT Samenvatting
WC01
Recap van vorig jaar.
Intronen zijn de delen die niet coderen van DNA RNA, exonen coderen wel van
DNA RNA.
DNA polymerase is het enzym dat wordt gebruikt bij transcriptie. Deze weet waar te
beginnen als hij de promotor tegen komt. Dit is een deel van de DNA sequentie waar
de transcriptie wordt gestart, hij fungeert als een soort ‘startsein’.
mRNA is al gespliced, alle intronen zijn hier al uitgehaald.
Reverse transcriptase is het proces waarbij we van mRNA cDNA maken. cDNA is
een kopie van het mRNA (copy DNA) deze heeft dus geen intronen. Alle nodige
informatie is dus aanwezig om eiwitten te maken. Dit wordt vooral in het lab gebruikt.
WC02
Isolatie DNA, RNA en eiwit.
Er zijn 2 regels bij het isoleren van DNA en/of RNA, namelijk:
1. Werk schoon
DNAse en RNAse vrijdag
o Deze breken DNA en RNA namelijk af.
2. Werk op ijs
Isoleren doe je in 5 stappen:
1. Het kapot maken van biologisch materiaal, dit kan weer op 2 manieren:
Osmotisch
o Molariteit verhogen, er ontstaat zwelling en hierdoor barsten
cellen open.
o Molariteit verlagen, de cellen verschrompelen en hierdoor gaan
ze lekken.
Enzymatisch
o Lysozym
o Proteinase K
2. Toevoegen van zout oplossing voor verdere scheiding.
3. Toevoegen van detergentia (zeep).
Oplossen van membranen in de cel.
Ontvouwen van eiwitten.
Verdrijving van watermantel, twee veel gebruikte zepen zijn:
o Triton X-100
o SDS
4. Binden van nucleïnezuren aan silicagel.
, 5. Elueren met water op TE-buffer.
WC03/WC04
PCR
Topo-isomerase ontvouwt de helixstructuur van het DNA. Helicase verbreekt de 2
strengen van elkaar. Polymerase bindt de goede basen aan de al bestaande ‘strand’.
Er zijn 3 stappen bij de PCR:
1. Denaturatie
Het epje wordt verhit, de waterstofbruggen worden verbroken en het
DNA wordt enkelstrengs.
2. Annealing
Hier worden er primers gebonden aan het enkelstrengs DNA.
3. Extensie
D.M.V. polymerase wordt het enkelstrengse DNA dubbelstrengs.
Van 1 dubbelstrengs DNA maak je dus 2 dubbelstrengs DNA, hiervan 2 4, van
4 8 ect. Dit groeit dus exponentieel.
PCR Protocol
Stap 0: initiële denaturatie van het DNA: 94-95 ⁰C, 5-10 min.
Stap 1: denaturatie: 94-95⁰C, 15-45 sec.
Stap 2: annealing van de primers: 45-60⁰C, 15-45 sec.
Stap 3: extensie: 72⁰C, 30 sec – 5 min.
Stap 4: laatste extensie: 72⁰C, 10 min.
Stap 1 t/m 3 herhaal je zo’n 25 tot 40 keer.
Regels voor het maken van goede primers:
Lengte, tussen de 16 en 24 nucleotiden lang.
G/C gehalte, tussen de 45-60%
Bij deze verhoudingen moet de smelttemperatuur tussen de 55-65 ⁰C zitten. Ook
moeten er tussen je forward en je reverse primer niet meer dan 5 ⁰C verschil zitten.
Als de smelt temperatuur te laag is verhoog dan je G/C gehalten en/of verleng de
primer een klein beetje.
Zorg dat je template goed aansluit op het 3’.
Zorg dat je voor G/C aan de 3’ kant hebt zitten maar
voorkom dat dit er meer dan 3 zijn.
Voorkom de vorming van structuren, bijv. een enkele
streng die met zichzelf een ‘hairpin’ kan vormen.
WC01
Recap van vorig jaar.
Intronen zijn de delen die niet coderen van DNA RNA, exonen coderen wel van
DNA RNA.
DNA polymerase is het enzym dat wordt gebruikt bij transcriptie. Deze weet waar te
beginnen als hij de promotor tegen komt. Dit is een deel van de DNA sequentie waar
de transcriptie wordt gestart, hij fungeert als een soort ‘startsein’.
mRNA is al gespliced, alle intronen zijn hier al uitgehaald.
Reverse transcriptase is het proces waarbij we van mRNA cDNA maken. cDNA is
een kopie van het mRNA (copy DNA) deze heeft dus geen intronen. Alle nodige
informatie is dus aanwezig om eiwitten te maken. Dit wordt vooral in het lab gebruikt.
WC02
Isolatie DNA, RNA en eiwit.
Er zijn 2 regels bij het isoleren van DNA en/of RNA, namelijk:
1. Werk schoon
DNAse en RNAse vrijdag
o Deze breken DNA en RNA namelijk af.
2. Werk op ijs
Isoleren doe je in 5 stappen:
1. Het kapot maken van biologisch materiaal, dit kan weer op 2 manieren:
Osmotisch
o Molariteit verhogen, er ontstaat zwelling en hierdoor barsten
cellen open.
o Molariteit verlagen, de cellen verschrompelen en hierdoor gaan
ze lekken.
Enzymatisch
o Lysozym
o Proteinase K
2. Toevoegen van zout oplossing voor verdere scheiding.
3. Toevoegen van detergentia (zeep).
Oplossen van membranen in de cel.
Ontvouwen van eiwitten.
Verdrijving van watermantel, twee veel gebruikte zepen zijn:
o Triton X-100
o SDS
4. Binden van nucleïnezuren aan silicagel.
, 5. Elueren met water op TE-buffer.
WC03/WC04
PCR
Topo-isomerase ontvouwt de helixstructuur van het DNA. Helicase verbreekt de 2
strengen van elkaar. Polymerase bindt de goede basen aan de al bestaande ‘strand’.
Er zijn 3 stappen bij de PCR:
1. Denaturatie
Het epje wordt verhit, de waterstofbruggen worden verbroken en het
DNA wordt enkelstrengs.
2. Annealing
Hier worden er primers gebonden aan het enkelstrengs DNA.
3. Extensie
D.M.V. polymerase wordt het enkelstrengse DNA dubbelstrengs.
Van 1 dubbelstrengs DNA maak je dus 2 dubbelstrengs DNA, hiervan 2 4, van
4 8 ect. Dit groeit dus exponentieel.
PCR Protocol
Stap 0: initiële denaturatie van het DNA: 94-95 ⁰C, 5-10 min.
Stap 1: denaturatie: 94-95⁰C, 15-45 sec.
Stap 2: annealing van de primers: 45-60⁰C, 15-45 sec.
Stap 3: extensie: 72⁰C, 30 sec – 5 min.
Stap 4: laatste extensie: 72⁰C, 10 min.
Stap 1 t/m 3 herhaal je zo’n 25 tot 40 keer.
Regels voor het maken van goede primers:
Lengte, tussen de 16 en 24 nucleotiden lang.
G/C gehalte, tussen de 45-60%
Bij deze verhoudingen moet de smelttemperatuur tussen de 55-65 ⁰C zitten. Ook
moeten er tussen je forward en je reverse primer niet meer dan 5 ⁰C verschil zitten.
Als de smelt temperatuur te laag is verhoog dan je G/C gehalten en/of verleng de
primer een klein beetje.
Zorg dat je template goed aansluit op het 3’.
Zorg dat je voor G/C aan de 3’ kant hebt zitten maar
voorkom dat dit er meer dan 3 zijn.
Voorkom de vorming van structuren, bijv. een enkele
streng die met zichzelf een ‘hairpin’ kan vormen.
