Samenvatting TIP! Hoorcolleges MBT 1 tm 6

MBT TENTAMEN HOORCOLLEGES


Inhoud

Table of Contents
Hoorcollege 2 PCR, kennisclips primer ontwerpen......................................................................................1
Informatie over de PCR techniek en het ontwerpen van primers................................................................7
Hoorcollege 3 Kloneren, kennisclips controleren, in frame, oriëntatie.....................................................11
Hoorcollege 4 Transfecteren en transformeren........................................................................................18
Hoorcollege 6 Real-time qPCR...................................................................................................................23
MBT WC6 HC5 DNA/RNA isolatie..............................................................................................................31
MBT WC8 HC7 Sequencen.........................................................................................................................36




MBT WC2 HC en kennisclips
Hoorcollege 2 PCR, kennisclips primer ontwerpen

,Overzicht
- DNA replicatie
- PCR
- Primers
- Primers ontwerpen
- Polymerase
- DNA template

Wat doet een PCR?
Vermeerderd/amplificeert een specifiek stuk DNA
Toepassingen
- Gen of promotor kopiëren om te kloneren
- Mensen, dieren en virussen identificeren
- Aanwezigheid specifieke DNA sequentie aantonen
- Aantonen van genetische ziekten
- Identificeren van bacteriële infectie
Waarop is PCR techniek gebaseerd?
DNA replicatie
- Helicase zorgt ervoor dat twee strengen uit elkaar gaan
- Primers worden gemaakt door primase, maakt RNA primers op
willekeurige plekken  aan primer bindt polymerase om DNA
te kopiëren
o DNA polymerase beweegt over DNA van 3’naar 5’
o DNA polymerase maakt nieuwe DNA van 5’naar 3’




Waarmee maak je een PCR reactie specifiek?
Door primers te ontwerpen en te bestellen  artificiële DNA primers (oligo’s)



Benodigheden PCR
- PCR machine
- PCR reactievaatjes

, - PCR reactiemengel
o DNA (template)
o 2 primers (forward en reverse)
o Nucleotiden
o Taq polymerase  hittestabiel, geen proofreading activiteit
 Proofreading  een polymerase die zijn eigen fouten hersteld/fouten uit DNA
streng haalt
o Buffer
- Analyse systeem: bijv agarose gel

PCR hoe werkt het?
1 Cyclus
1. Denaturatie (uitsmelten)  96 graden
2. Annealing (hybridisatie/plakken primer)  50-65 graden
3. Extensie (elongatie/maken DNA door polymerase)  72 graden met Taq Polymerase*
*in een cel is de temperatuur 37 graden met polymerase (Polα, Polδ, Polɛ)
Na n cycli heb je 2n keer zoveel materiaal
- Tussen elke stap  detectie fluorescentie

Ontwerpen van primers
Primers
- Korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nucleotiden)
- Andere naam: oligo’s
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G, A, T, C
- Elke sequentie is te maken
- Specifiek




Algemene regels voor design primers

, - 3’-end moet G of C zijn (sterke binding  3 H-bruggen, polymerase bindt beter)
- 17-28 baseparen
- 40-60% GC
- Primer dimeren voorkomen (primers zitten aan elkaar)
- Voorkom interne “self-annealing’
- Tm tussen 55 en 70 graden
o Tm = gemiddelde temperatuur waarin helft primers binden, 50% bindt nog aan target
sequentie
o Tm bereken voor 15-25 basen:
Tm= 2(A+T) + 4(C+G)
(A, T, C, G  aantal van deze basen)
Annealingstemperatuur (Ta) = Tm – 5 graden
Te lage annealingstemperatuur  a-specifieke PCR producten en/of meerdere PCR producten
- Temperatuur niet hoog genoeg waardoor verschillende basen niet ontkoppeld worden

Verschillende tijden voor amplificatie DNA
- Hoe groter het PCR product, hoe langer het duurt
- Sommige polymerases zijn langzaam
- Sommige stukken DNA zijn moeilijk te amplificeren (zeldzaam)

Taq DNA polymerase heeft geen proofreading. Pwo en Pfu DNA polymerases hebben wel proofreading
activiteit. Polymerases worden geïsoleerd uit archeabacteria. Door proofreading wordt activiteit
langzamer, maar wel met minder fouten.

Voorwaarde template DNA
- Meestal wordt DNA gezuiverd
- Geen remmers van DNA polymerase
o Bijvoorbeeld heemgroep in hemoglobine, humuszuur in aarde
- Target bereikbaar voor primers en Taq
- Geen EDTA (of hele lage concentratie): Mg2+
- Niet teveel fragmentatie/afbraak
- Niet te vaak vriezen/ontdooien

Factoren die degradatie van DNA bevorderen
- Tijd
- Temperatuur
- Vochtigheid
- Licht (UV)
- Blootstelling aan chemicaliën (ook tijdens de opzuivering en analyse)




Kennisclip primer ontwerp met de hand